Pancreapedia

Gensymbol:

1. Allmänt

Pankreatiskt ribonukleas även känt som ribonukleas A (RNas A) eller ribonukleas 1 (RNas1) är ett enzym som katalyserar nedbrytningen av RNA och spelar en roll i matsmältningen av RNA hos ryggradsdjur. Tidigt arbete inriktades på RNas från bovint pankreas på grund av den stora mängd som finns i bukspottkörteln. Det har beskrivits som det bäst studerade enzymet under 1900-talet och fyra Nobelpris har tilldelats för studier av detta protein (20). På grund av de höga halter som finns i bovin bukspottkörtel har RNas1 historiskt sett betraktats som ett matsmältningsenzym, men med litet syfte hos människor och andra däggdjur som inte är idisslare (2), där det finns i mycket lägre koncentrationer. Nedbrytning av RNA sker dock i tarmen hos alla arter och RNas1 och andra medlemmar av dess superfamilj är nu kända för att ha ytterligare funktioner i värdförsvaret som kommer att diskuteras senare.

Struktur och verkningsmekanism

Bovint RNas1 renades och kristalliserades av Kunitz 1939 (16) och sekvenserades av Smyth, Stein och Moore 1963 (30). Det innehåller 124 aminosyror, en beräknad molekylvikt på 13 683 och ett överskott av basiska rester som leder till en isoelektrisk punkt på 8,5 – 9,0. Den innehåller fyra disulfidbindningar och har använts som modell för att studera proteinveckning (22). Den är också glykosylerad på asparaginrester och den glykosylerade formen kallades ursprungligen RNas B. På grund av glykosyleringen och den tertiära strukturen löper den på de flesta SDS-geler vid 18 eller 19 kDa. RNas 1 från svin innehåller 125 aminosyror (26). RNas 1 från människa innehåller ytterligare 3 aminosyror vid karboxylterminalen jämfört med RNas 1 från nötkreatur (4). RNase1 från nötkreatur var det första enzym vars tredimensionella struktur bestämdes. Det har en övergripande form som liknar en kidneyböna med den aktiva platsen i klyftan som innehåller His12, His119 och Lys41 (25). Andra icke-katalytiska bindningsställen hjälper enzymet att bilda ett komplex med sitt polymera substrat. RNas1 katalyserar hydrolysen av 3′,5′-fosfodiesterlänkar i enkelsträngat RNA när basen på 3′-sidan är ett pyrimidin (7, 11, 23). Processen framställs vanligen som att den sker i två steg där det första steget innefattar bildandet av en cyklisk fosfodiester och det andra dess hydrolys (23). RNas 1 hydrolyserar inte DNA eftersom det saknar en 2′-OH-grupp. Detta gör att det kan användas för att avlägsna RNA-kontaminering från DNA. Det används också i ribonukleasskyddstester. RNas 1 bildar dimerer genom domänbyten av aminoterminaler genom sulfhydrylbindningsbildning på ett sådant sätt att varje aktiv plats hålls aktiv (18). Samtidigt som de behåller den hydrolytiska funktionen får dimererna ytterligare en biologisk aktivitet med dimerer, trimerer och tetramerer som har antitumöraktivitet

Ribonukleas A Superfamily

Den mänskliga arvsmassan kodar för 122 separata ribonukleaser. RNAse A superfamiljen består av åtta ”kanoniska” ribonukleaser med enzymatisk aktivitet och strukturell homologi med RNas A (15). Alla är sekretoriska proteiner som delar en disulfidbunden tertiärstruktur och kan bryta ned RNA. Alla kodas för i en snäv region på kromosom 14 hos både människor och möss (27) och tros ha sitt ursprung i en gendubblering (3, 31). Även om genen innehåller flera exoner bidrar den kodande regionen med en enda exon. Förståelsen av deras fysiologiska roll är ofullständig, men de flesta är viktiga för värdförsvar och angiogenes samt matsmältning (9). Den första medlemmen som beskrivs är RNas 1 som förutom att vara ett enzym från bukspottkörteln produceras i en mängd olika celler inklusive vaskulära endotelceller där det efter sekretion bryter ned vaskulärt polymert RNA och har anti-HIV-1-aktivitet (15). RNas 2 och 3 är eosinofila sekretoriska proteiner som benämns eosinofil derived neurotoxin (EDN) respektive eosinofilt kationiskt protein (ECP) (15). RNas 4 finns i flera vävnader men dess fysiologiska roll är oklar. RNas 5, även känt som angiogenin, inducerar blodkärlstillväxt (10). RNas 7 är det mest förekommande RNaset i huden medan RNas 8 uttrycks i placenta (15). Ytterligare gener i klustret är relaterade till ribonukleaser (RNas 9-13) men deras proteiner har mutationer som förhindrar RNasaktivitet. Vissa av de utsöndrade RNaserna eller deras oligomerer kan tränga in i celler och utöva cytotoxiska effekter särskilt på tumörceller.

Ribonukleasinhibitor

Mammalian ribonukleasinhibitor (RI) är ett cytosoliskt protein på 50 KDa som med hög affinitet och 1:1 stökiometri binder sig till bukspottkörtelns ribonukleas och därigenom inaktiverar det (8, 17). Det är särskilt rikligt förekommande i placenta och lever och har använts för att rena RNas. Det hämmar alla medlemmar av RNas A-familjen. Dess tredimensionella struktur är en hästsko som innehåller leucinrika upprepningar. Även om den biologiska rollen inte är klarlagd bör den binda och inaktivera varje medlem av RNas A-familjen som undkommer den sekretoriska vägen och kommer in i cytoplasman.

2. Ribonukleasets roll i bukspottkörteln

De flesta celler innehåller millimolära koncentrationer av ribonukleotider, men endast mikromolära koncentrationer av desoxyribonukleotider (5). Kosten innehåller således en blandning av ribonukleoprotein, RNA och ribonukleotider. Nukleoproteinerna bryts ner av proteas från bukspottkörteln. Enligt läroboken bryts nukleinsyror från kosten ner av RNas och DNas från bukspottkörteln i tarmen. En nyligen genomförd studie har dock visat att pepsin i magsäcken också hydrolyserar nukleinsyra, så denna nedbrytning börjar där (19). Livsmedel som är rika på ribonukleoproteiner är bland annat organkött, skaldjur och baljväxter (5).

Pankreas RNas (RNas 1) finns i alla ryggradsdjurs bukspottkörtlar, men mängden varierar kraftigt (2). Däggdjur med stora mängder inkluderar hovdjur, gnagare och växtätande pungdjur. Hos kon utgör RNas 20 % av matsmältningsenzymerna; detta krav tros bero på den stora RNA-belastning som produceras av bakterier från ruminal jäsning. Hos andra arter, inklusive människor, hundar, katter och lägre ryggradsdjur, förekommer RNas i mycket mindre mängder och kan utgöra endast 0,5-1 % av enzymerna i bukspottkörteln. Även om det bara finns ett fåtal studier verkar pankreatiskt RNas hos alla arter bryta ner kostens nukleinsyra i tarmlumen till nukleotider som bryts ner ytterligare av tarmens alkaliska fosfatas och 5’nukleotidas till nukleosider och fria kvävebaserade baser. Nedbrytningen av nukleinsyror har därför en luminal fas och en fas vid borstkanten. Dessa produkter absorberas av enterocyter men de flesta utsöndras i urinen. En del används för resyntes främst i fastande tillstånd (13, 21, 29). Normalt absorberas 80-90 % av nukleotiderna och dessa kan bli essentiella vid vissa sjukdomar eller perioder med begränsat intag eller snabb tillväxt (5).

Ribonukleas syntetiseras i acinarceller av grovt ER, viks och paketeras i zymogengranuler med början vid 20 dagars dräktighet hos råtta (33). Vikningen sker mycket snabbare i cellerna jämfört med det isolerade proteinet och förutom en liten mängd dimer bryts alla proteiner som inte slutar som en veckad monomer ner (12). Det utsöndras i mediet parallellt med andra matsmältningsenzymer av pankreaslober och acini som stimuleras med CCK eller kolinerga analoger (14, 24, 28). RNas 1-syntesen minskar vid experimentell diabetes med 50 %, men mycket mindre än minskningen för amylas.

3. Verktyg för att studera ribonukleas 1

a. Antikroppar

Biocompare (www.biocompare.com) listar 394 antikroppar mot ribonukleas från 32 leverantörer. Vissa är artspecifika medan andra är specifika för RNase1 eller andra familjemedlemmar. Vi har inte testat någon av dessa antikroppar.

b. Ribonukleasaktivitet

I tidiga ribonukleasbestämningar användes hydrolys av jäst-RNA; vi använde en bestämning som beskrevs av Anfinsen (1) för att mäta utsöndringen av pankreatiskt ribonukleas av isolerade pankreasacini från råttor (24). Dessa tester är dock inte specifika för RNas1 och fungerade för studiet av sekretion av pankreasacinarer eftersom RNas1 är den huvudsakliga formen som finns i pankreasacinarer. En analys har också beskrivits med hjälp av hydrolys av cytidin 2′-3′-fosfat (6). Nyligen utvecklades en kvantitativ fluorescensanalys baserad på bindning av ethidiumbromid till jäst-RNA (32).

4. Referenser

  1. Anfinsen CB, Redfield RR, Choate WL, Page J och Carroll WR. Studier av bruttostruktur, tvärbindningar och terminala sekvenser i ribonukleas. J Biol Chem 207: 201-210, 1954. PMID: 13152095
  2. Barnard EA. Biologisk funktion hos ribonukleas från bukspottkörteln. Nature 221: 340-344, 1969. PMID: 4974403
  3. Beintema JJ och Kleineidam RG. Överfamiljen ribonukleas A: allmän diskussion. Cell Mol Life Sci 54: 825-832, 1998. PMID: 9760991
  4. Beintema JJ, Wietzes P, Weickmann JL och Glitz DG. Aminosyrasekvensen för humant ribonukleas från bukspottkörteln. Anal Biochem 136: 48-64, 1984. PMID: 6201087
  5. Carver JD, and Walker, WA. Nukleotidernas roll i människans näring. J Nutr Biochem 6: 58 – 72, 1995.
  6. Crook EM, Mathias AP och Rabin BR. Spektrofotometrisk analys av bovint pankreatiskt ribonukleas med hjälp av cytidin 2′:3′-fosfat. Biochem J 74: 234-238, 1960. PMID: 13812977
  7. Cuchillo CM, Nogues MV och Raines RT. Bovint pankreatiskt ribonukleas: femtio år efter den första enzymatiska reaktionsmekanismen. Biochemistry 50: 7835-7841, 2011. PMID: 21838247
  8. Dickson KA, Haigis MC och Raines RT. Ribonukleashämmare: struktur och funktion. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 80: 349-374, 2005. PMID: 16164979
  9. Dyer KD och Rosenberg HF. RNase a superfamiljen: generering av mångfald och medfött värdförsvar. Mol Divers 10: 585-597, 2006. PMID: 16969722
  10. Fett JW, Strydom DJ, Lobb RR, Alderman EM, Bethune JL, Riordan JF och Vallee BL. Isolering och karakterisering av angiogenin, ett angiogent protein från mänskliga cancerceller. Biokemi 24: 5480-5486, 1985. PMID: 4074709
  11. Findlay D, Herries DG, Mathias AP, Rabin BR och Ross CA. Den aktiva platsen och verkningsmekanismen för bovint pankreatiskt ribonukleas. Nature 190: 781-784, 1961. PMID: 13699542
  12. Geiger R, Gautschi M, Thor F, Hayer A och Helenius A. Folding, quality control, and secretion of pancreatic ribonuclease in live cells. J Biol Chem 286: 5813-5822, 2011. PMID: 21156800
  13. Ho CY, Miller KV, Savaiano DA, Crane RT, Ericson KA och Clifford AJ. Absorption och metabolism av oralt administrerade puriner hos matade och fastande råttor. J Nutr 109: 1377-1382, 1979. PMID: 458492
  14. Iwanij V och Jamieson JD. Biokemisk analys av sekretoriska proteiner som syntetiseras av normal bukspottkörteln hos råttor och av tumörceller i bukspottkörtelns acinärceller. J Cell Biol 95: 734-741, 1982. PMID: 6185502
  15. Koczera P, Martin L, Marx G och Schuerholz T. The Ribonuclease A Superfamily in Humans: Kanoniska RNaser som stöd för den medfödda immuniteten. Int J Mol Sci 17: 2016. PMID: 27527162
  16. Kunitz M. Crystalline Ribonuclease. J Gen Physiol 24: 15-32, 1940. PMID: 19873197
  17. Lee FS och Vallee BL. Struktur och verkan av ribonukleas (angiogenin)-hämmare från däggdjur. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 44: 1-30, 1993. PMID: 8434120
  18. Libonati M. Biological actions of the oligomers of ribonuclease A. Cell Mol Life Sci 61: 2431-2436, 2004. PMID: 15526151
  19. Liu Y, Zhang Y, Dong P, An R, Xue C, Ge Y, Wei L och Liang X. Nedbrytning av nukleinsyror börjar i magsäcken. Sci Rep 5: 11936, 2015. PMID: 26168909
  20. Marshall GR, Feng JA och Kuster DJ. Back to the future: ribonuclease A. Biopolymers 90: 259-277, 2008. PMID: 17868092
  21. McAllan AB. Nedbrytning av nukleinsyror i och avlägsnande av nedbrytningsprodukter från tunntarmen hos stutar. Br J Nutr 44: 99-112, 1980. PMID: 6158999
  22. Moore S och Stein WH. Kemiska strukturer för pankreatiskt ribonukleas och deoxyribonukleas. Science 180: 458-464, 1973. PMID: 4573392
  23. Nogues MV, Vilanova M och Cuchillo CM. Bovint pankreatiskt ribonukleas A som modell för ett enzym med flera substratbindningsställen. Biochim Biophys Acta 1253: 16-24, 1995. PMID: 7492594
  24. Otsuki M och Williams JA. Effekten av diabetes mellitus på regleringen av enzymutsöndring från isolerade pankreasacini hos råttor. J Clin Invest 70: 148-156, 1982. PMID: 6177717
  25. Raines RT. Ribonukleas A. Chem Rev 98: 1045-1066, 1998.
  26. Reinhold VN, Dunne FT, Wriston JC, Schwarz M, Sarda L och Hirs CH. Isolering av ribonukleas från svin, ett glykoprotein, från bukspottkörtelsaft. J Biol Chem 243: 6482-6494, 1968. PMID: 5715511
  27. Samuelson LC, Wiebauer K, Howard G, Schmid RM, Koeplin D och Meisler MH. Isolering av den murina ribonukleasegenen Rib-1: struktur och vävnadsspecifikt uttryck i bukspottkörteln och parotiskörteln. Nucleic Acids Res 19: 6935-6941, 1991. PMID: 1840677
  28. Scheele GA och Palade GE. Studier av marsvinets bukspottkörtel. Parallell utmatning av exokrina enzymaktiviteter. J Biol Chem 250: 2660-2670, 1975. PMID: 1123325
  29. Schwenk M, Hegazy E och Lopez del Pino V. Uridinupptag av isolerade tarmepitelceller från marsvin. Biochim Biophys Acta 805: 370-374, 1984. PMID: 6210111
  30. Smyth DG, Stein WH och Moore S. The sequence of amino acid residues in bovine pancreatic ribonuclease: revised and confirmations. J Biol Chem 238: 227-234, 1963. PMID: 13989651
  31. Sorrentino S. De åtta mänskliga ”kanoniska” ribonukleaserna: molekylär mångfald, katalytiska egenskaper och speciella biologiska åtgärder hos enzymproteinerna. FEBS Lett 584: 2194-2200, 2010. PMID: 20388512
  32. Tripathy DR, Dinda AK och Dasgupta S. A simple assay for the ribonuclease activity of ribonucleases in the presence of ethidium bromide. Anal Biochem 437: 126-129, 2013. PMID: 23499964
  33. Van Nest GA, MacDonald RJ, Raman RK och Rutter WJ. Proteiner som syntetiseras och utsöndras under pankreasutvecklingen hos råttor. J Cell Biol 86: 784-794, 1980. PMID: 7410479

Lämna ett svar

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.