Pancreapedia

Simbol genic: RNASE1

1. Generalități

Ribonucleaza pancreatică, cunoscută și sub numele de ribonucleaza A (RNază A) sau ribonucleaza 1 (RNază1), este o enzimă care catalizează descompunerea ARN-ului și joacă un rol în digestia ARN-ului la speciile vertebrate. Primele lucrări s-au concentrat asupra RNazei pancreatice bovine, datorită cantității mari prezente în pancreas. A fost descrisă ca fiind cea mai bine studiată enzimă a secolului XX, patru premii Nobel fiind acordate pentru studii asupra acestei proteine (20). Datorită nivelurilor ridicate prezente în pancreasul bovin, RNase1 a fost considerată istoric ca fiind o enzimă digestivă, dar cu un scop redus la om și la alte mamifere nerumegătoare (2), unde există în concentrații mult mai mici. Cu toate acestea, digestia ARN-ului are loc în intestinul tuturor speciilor, iar RNase1 și alți membri ai superfamiliei sale sunt acum cunoscuți ca având funcții suplimentare în apărarea gazdei, care vor fi discutate mai târziu.

Structura și mecanismul de acțiune

RNAza1 bovină a fost purificată și cristalizată de Kunitz în 1939 (16) și secvențiată de Smyth, Stein și Moore în 1963 (30). Conține 124 aminoacizi, o greutate moleculară calculată de 13.683 și un exces de reziduuri bazice care conduce la un punct izoelectric de 8,5 – 9,0. Conține patru legături disulfidice și a fost utilizată ca model pentru a studia plierea proteinelor (22). Este, de asemenea, glicozilată pe reziduuri de asparagină, forma glicozilată fiind denumită inițial RNază B. Din cauza glicozilării și a structurii terțiare, se prezintă pe majoritatea gelurilor SDS la 18 sau 19 kDa. RNaza 1 porcină conține 125 de aminoacizi (26); RNaza 1 umană conține 3 aminoacizi în plus la terminalul carboxil decât RNaza 1 bovină (4). RNază bovină 1 a fost prima enzimă a cărei structură tridimensională a fost determinată. Aceasta are o formă generală asemănătoare cu cea a unui bob de fasole, cu situsul activ în fantă conținând His12, His119 și Lys41 (25). Alte situsuri de legare necatalitice ajută enzima să formeze un complex cu substratul său polimeric. RNase1 catalizează hidroliza legăturilor 3′,5′-fosfodiesterice din ARN monocatenar atunci când baza de pe partea 3′ este o pirimidină (7, 11, 23). Procesul este de obicei reprezentat ca având loc în două etape, prima etapă implicând formarea unui fosfodiester ciclic și cea de-a doua hidroliza acestuia (23). RNază 1 nu hidrolizează ADN-ul, deoarece nu are o grupare 2′-OH. Acest lucru îi permite să fie utilizată pentru a elimina contaminarea cu ARN din ADN. Este, de asemenea, utilizată în testele de protecție împotriva ribonucleazei. RNază 1 formează dimeri prin schimbarea de domeniu a terminațiilor amino prin formarea de legături sulfhidrilice, astfel încât fiecare situs activ să rămână activ (18). În timp ce își păstrează funcția hidrolitică, dimerii dobândesc o activitate biologică suplimentară, dimerii, trimerii și tetramerii având activitate antitumorală

Superfamilia ribonucleazei A

Genomul uman codifică 122 de ribonucleaze distincte. Superfamilia RNAse A este formată din opt ribonucleaze „canonice” cu activitate enzimatică și omologie structurală cu RNaza A (15). Toate sunt proteine secretorii care au în comun o structură terțiară cu legătură disulfură și sunt capabile să degradeze ARN. Toate sunt codificate într-o regiune restrânsă a cromozomului 14 atât la om, cât și la șoarece (27) și se crede că își au originea în urma duplicării genelor (3, 31). Deși gena conține mai mulți exoni, regiunea codificatoare este contribuită de un singur exon. Înțelegerea rolului lor fiziologic este incompletă, dar majoritatea sunt importante pentru apărarea gazdei și angiogeneză, precum și pentru digestie (9). Primul membru care a fost descris este RNază 1 care, pe lângă faptul că este o enzimă pancreatică, este produsă într-o varietate de celule, inclusiv în celulele endoteliale vasculare, unde, după secreție, degradează ARN polimeric vascular și are activitate anti-HIV-1 (15). RNaza 2 și 3 sunt proteine secretate de eozinofile denumite neurotoxină derivată din eozinofile (EDN) și, respectiv, proteină cationică eozinofilă (ECP) (15). RNază 4 este prezentă în mai multe țesuturi, dar rolul său fiziologic nu este clar. RNază 5, cunoscută și sub numele de angiogenină, induce creșterea vaselor de sânge (10). RNază 7 este cea mai abundentă RNază în piele, în timp ce RNază 8 este exprimată în placentă (15). Alte gene din grup sunt legate de ribonucleaze (RNase 9-13), dar proteinele lor prezintă mutații care împiedică activitatea RNazei. Unele dintre RNazele secretate sau oligomerii lor pot pătrunde în celule și pot exercita efecte citotoxice în special asupra celulelor tumorale.

Inhibitor de ribonuclează

Inhibitorul de ribonuclează de mamifere (RI) este o proteină citosolică de 50 KDa care se leagă cu mare afinitate și stoichiometrie 1:1 de ribonucleaza pancreatică, inactivând-o astfel (8, 17). Este deosebit de abundent în placentă și în ficat și a fost utilizat pentru purificarea RNazei. Inhibă toți membrii familiei de RNază A. Structura sa tridimensională este cea a unei potcoave care conține repetări bogate în leucină. Deși rolul biologic nu este clar, ar trebui să se lege și să inactiveze orice membru al familiei RNază A care scapă de calea secretorie și intră în citoplasmă.

2. Rolul ribonucleazei în pancreas

Majoritatea celulelor conțin concentrații milimolare de ribonucleotide, dar numai concentrații micromolare de dezoxiribonucleotide (5). Astfel, dieta conține un amestec de ribonucleoproteine, ARN și ribonucleotide. Nucleoproteinele sunt descompuse de proteaza pancreatică. Punctul de vedere al manualului este că acizii nucleici din alimentație sunt descompuși de RNază și DNază pancreatică în intestin. Cu toate acestea, un studiu recent a arătat că pepsina din stomac hidrolizează, de asemenea, acidul nucleic, deci această digestie începe acolo (19). Alimentele bogate în ribonucleoproteine includ organele de carne, fructele de mare și legumele (5).

RNAza pancreatică (RNază 1) este prezentă în toate pancreasurile vertebratelor, dar cantitatea variază foarte mult (2). Printre mamiferele cu cantități mari se numără ungulatele, rozătoarele și marsupialele erbivore. La vacă, RNaza reprezintă 20% din enzima digestivă; se crede că această cerință se datorează încărcăturii mari de ARN care este produsă de bacteriile din fermentația ruminală. La alte specii, inclusiv la om, câine, pisică și vertebrate inferioare, RNaza este prezentă în cantități mult mai mici și poate reprezenta doar 0,5 până la 1% din enzimele pancreatice. Deși există doar câteva studii, se pare că, la toate speciile, RNaza pancreatică descompune acidul nucleic alimentar din lumenul intestinal în nucleotide, care sunt ulterior descompuse de fosfataza alcalină intestinală și de 5’nucleotidaza în nucleozide și baze azotate libere. Prin urmare, digestia acizilor nucleici are o fază luminală și o fază la marginea periei. Acești produși sunt absorbiți de enterocite, dar majoritatea sunt excretați în urină; unii sunt utilizați pentru resinteză în principal în stare de post (13, 21, 29). În mod normal, 80 până la 90% din nucleotide sunt absorbite, iar acestea pot deveni esențiale în anumite boli sau perioade de aport limitat sau de creștere rapidă (5).

Ribonucleaza este sintetizată în celulele acinare de către ER grosier, pliată și împachetată în granule de zimogen începând cu 20 de zile de gestație la șobolan (33). Plierea are loc mult mai rapid în celule în comparație cu proteina izolată și, cu excepția unei cantități mici de dimer, orice proteină care nu se termină sub formă de monomer pliat este degradată (12). Este secretată în mediu în paralel cu alte enzime digestive de către lobulii și acinii pancreatici stimulați cu CCK sau cu analogi colinergici (14, 24, 28). Sinteza de RNază 1 este redusă în diabetul experimental cu 50%, dar mult mai puțin decât scăderea pentru amilază.

3. Instrumente pentru studiul ribonucleazei1

a. Anticorpi

Biocompare (www.biocompare.com) enumeră 394 de anticorpi împotriva ribonucleazei de la 32 de furnizori. Unii sunt specifici pentru anumite specii, în timp ce alții sunt specifici pentru RNase1 sau pentru alți membri ai familiei. Nu am testat niciunul dintre acești anticorpi.

b. Activitatea ribonucleazei

Primele teste de ribonuclează au folosit hidroliza ARN-ului de drojdie; noi am folosit un test descris de Anfinsen (1) pentru a măsura secreția de ribonuclează pancreatică de către acinii pancreatici de șobolan izolați (24). Totuși, aceste teste nu sunt specifice pentru RNază1 și au funcționat pentru studiul secreției acinilor pancreatici, deoarece RNază1 este forma majoră prezentă în acinii pancreatici. S-a descris, de asemenea, un test care utilizează hidroliza 2′-3′-fosfatului de ctidină (6). Recent a fost dezvoltat un test cantitativ de fluorescență bazat pe legarea bromurii de etidiu la ARN de drojdie (32).

4. Referințe

  1. Anfinsen CB, Redfield RR, Choate WL, Page J, and Carroll WR. Studii privind structura brută, legăturile încrucișate și secvențele terminale în ribonuclază. J Biol Chem 207: 201-210, 1954. PMID: 13152095
  2. Barnard EA. Funcția biologică a ribonucleazei pancreatice. Nature 221: 340-344, 1969. PMID: 4974403
  3. Beintema JJ, și Kleineidam RG. Superfamilia ribonucleazei A: discuție generală. Cell Mol Life Sci 54: 825-832, 1998. PMID: 976099991
  4. Beintema JJ, Wietzes P, Weickmann JL, și Glitz DG. Secvența de aminoacizi a ribonucleazei pancreatice umane. Anal Biochem 136: 48-64, 1984. PMID: 6201087
  5. Carver JD, și Walker, WA. Rolul nucleotidelor în nutriția umană. J Nutr Biochem 6: 58 – 72, 1995.
  6. Crook EM, Mathias AP, și Rabin BR. Dozarea spectrofotometrică a ribonucleazei pancreatice bovine prin utilizarea 2′:3′-fosfatului de ctidină. Biochem J 74: 234-238, 1960. PMID: 13812977
  7. Cuchillo CM, Nogues MV, și Raines RT. Bovine pancreatic ribonuclease: cincizeci de ani de la primul mecanism de reacție enzimatică. Biochimie 50: 7835-7841, 2011. PMID: 21838247
  8. Dickson KA, Haigis MC, și Raines RT. Inhibitor de ribonuclează: structură și funcție. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 80: 349-374, 2005. PMID: 16164979
  9. Dyer KD, și Rosenberg HF. Superfamilia RNase a: generarea diversității și apărarea înnăscută a gazdei. Mol Divers 10: 585-597, 2006. PMID: 16969722
  10. Fett JW, Strydom DJ, Lobb RR, Alderman EM, Bethune JL, Riordan JF, și Vallee BL. Izolarea și caracterizarea angiogeninei, o proteină angiogenică din celulele de carcinom uman. Biochimie 24: 5480-5486, 1985. PMID: 4074709
  11. Findlay D, Herries DG, Mathias AP, Rabin BR, și Ross CA. Situl activ și mecanismul de acțiune al ribonucleazei pancreatice bovine. Nature 190: 781-784, 1961. PMID: 13699542
  12. Geiger R, Gautschi M, Thor F, Hayer A, and Helenius A. Folding, quality control, and secretion of pancreatic ribonuclease in live cells. J Biol Chem 286: 5813-5822, 2011. PMID: 21156800
  13. Ho CY, Miller KV, Savaiano DA, Crane RT, Ericson KA, și Clifford AJ. Absorbția și metabolismul purinelor administrate pe cale orală la șobolanii hrăniți și la post. J Nutr 109: 1377-1382, 1979. PMID: 458492
  14. Iwanij V, și Jamieson JD. Analiza biochimică a proteinelor secretorii sintetizate de pancreasul normal de șobolan și de celulele tumorale acinare pancreatice. J Cell Biol 95: 734-741, 1982. PMID: 6185502
  15. Koczera P, Martin L, Marx G, și Schuerholz T. The Ribonuclease A Superfamily in Humans: Canonical RNases as the Buttress of Innate Immunity. Int J Mol Sci 17: 2016. PMID: 27527162
  16. Kunitz M. Crystalline Ribonuclease. J Gen Physiol 24: 15-32, 1940. PMID: 19873197
  17. Lee FS, și Vallee BL. Structura și acțiunea inhibitorului ribonucleazei mamiferelor (angiogenină). Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 44: 1-30, 1993. PMID: 8434120
  18. Libonati M. Biological actions of the oligomers of ribonuclease A. Cell Mol Life Sci 61: 2431-2436, 2004. PMID: 15526151
  19. Liu Y, Zhang Y, Dong P, An R, Xue C, Ge Y, Wei L, și Liang X. Digestia acizilor nucleici începe în stomac. Sci Rep 5: 11936, 2015. PMID: 26168909
  20. Marshall GR, Feng JA, și Kuster DJ. Înapoi în viitor: ribonucleaza A. Biopolymers 90: 259-277, 2008. PMID: 17868092
  21. McAllan AB. Degradarea acizilor nucleici în, și eliminarea produselor de degradare din intestinul subțire al boilor. Br J Nutr 44: 99-112, 1980. PMID: 6158999
  22. Moore S, și Stein WH. Structuri chimice ale ribonucleazei și deoxiribonucleazei pancreatice. Science 180: 458-464, 1973. PMID: 4573392
  23. Nogues MV, Vilanova M, și Cuchillo CM. Bovine pancreatic ribonuclease A ca model de enzimă cu situsuri multiple de legare a substratului. Biochim Biophys Acta 1253: 16-24, 1995. PMID: 7492594
  24. Otsuki M, și Williams JA. Efectul diabetului zaharat asupra reglării secreției enzimatice de către acinii pancreatici de șobolan izolați. J Clin Invest 70: 148-156, 1982. PMID: 6177717
  25. Raines RT. Ribonuclease A. Chem Rev 98: 1045-1066, 1998.
  26. Reinhold VN, Dunne FT, Wriston JC, Schwarz M, Sarda L, și Hirs CH. Izolarea ribonuclazei porcine, o glicoproteină, din sucul pancreatic. J Biol Chem 243: 6482-6494, 1968. PMID: 5715511
  27. Samuelson LC, Wiebauer K, Howard G, Schmid RM, Koeplin D, și Meisler MH. Izolarea genei ribonucleazei murine Rib-1: structura și expresia specifică a țesuturilor în pancreas și glanda parotidă. Nucleic Acids Res 19: 6935-6941, 1991. PMID: 1840677
  28. Scheele GA, și Palade GE. Studii asupra pancreasului cobaiului. Descărcarea paralelă a activităților enzimatice exocrine. J Biol Chem 250: 2660-2670, 1975. PMID: 1123325
  29. Schwenk M, Hegazy E, și Lopez del Pino V. Captarea uridinei de către celulele epiteliale intestinale izolate de cobai. Biochim Biophys Acta 805: 370-374, 1984. PMID: 6210111
  30. Smyth DG, Stein WH și Moore S. Secvența de reziduuri de aminoacizi din ribonucleaza pancreatică bovină: revizuiri și confirmări. J Biol Chem 238: 227-234, 1963. PMID: 13989651
  31. Sorrentino S. Cele opt ribonucleaze umane „canonice”: diversitate moleculară, proprietăți catalitice și acțiuni biologice speciale ale proteinelor enzimatice. FEBS Lett 584: 2194-2200, 2010. PMID: 20388512
  32. Tripathy DR, Dinda AK și Dasgupta S. A simple assay for the ribonuclease activity of ribonucleases in the presence of ethidium bromide. Anal Biochem 437: 126-129, 2013. PMID: 23499964
  33. Van Nest GA, MacDonald RJ, Raman RK și Rutter WJ. Proteine sintetizate și secretate în timpul dezvoltării pancreasului de șobolan. J Cell Biol 86: 784-794, 1980. PMID: 7410479

Leave a Reply

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.