Nanobody

4.3 BBB-crossing bsAbs engineered with single-domain antibodies

sdAbs sunt fragmente mici (15 kDa), monomerice de anticorpi care se leagă de antigen, care oferă diverse avantaje față de alte fragmente de anticorpi ca „blocuri de construcție” pentru bsAbs. Aceștia apar în natură ca porțiune de legare a antigenului a anticorpilor cu lanț greu la speciile de camelide (numiți VHH) și la peștii cartilaginoși (numiți VNAR) sau pot fi generați din IgG-uri convenționale prin obținerea sau ingineria domeniilor VH sau VL monomerice, stabile (Hamers-Casterman et al., 1993; Hussack et al., 2012; Kim et al, 2014; Nuttall, 2012; Ward, Güssow, Griffiths, Jones, & Winter, 1989). sdAbs sunt foarte stabile și compacte și pot accesa epitopi încastrați în proteine, cum ar fi cavitățile receptorilor sau situsurile active ale enzimelor, care sunt adesea „ascunse” de IgG-urile convenționale și pot atinge afinități de legare a țintei comparabile cu cele ale anticorpilor convenționali (Lauwereys et al., 1998; Staus et al., 2014). Aceste unități monomerice de legare a antigenului nu se împerechează cu lanțurile ușoare, ceea ce le face excelente blocuri de construcție pentru bsAbs heterodimerizați, deoarece evită dificultățile legate de împerecherea necorespunzătoare a lanțurilor ușoare (Hamers-Casterman et al., 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). Se pot crea bsAbs heterodimerici în care unul sau ambele „brațe” sunt sdAb, aceștia din urmă având o structură similară cu cea a anticorpilor cu lanț greu de la camelide (Fig. 3E). sdAbs pot fi, de asemenea, utilizați în diverse fuziuni mono-, bi- sau tetravalente cu anticorpi terapeutici convenționali sau Fabs (Fig. 3E), rezultând, în general, molecule mai mici și mai puțin complexe, în comparație cu cele generate cu scFvs sau Fabs ca blocuri de construcție, care tind să se comporte bine din punct de vedere biofizic și să fie ușor de produs (Holliger & Hudson, 2005). Umanizarea VHH-urilor, precum și ingineria sdAbs este bine descrisă, permițând generarea cu ușurință de sdAbs umani(izați) cu afinitate optimă față de țintă și proprietăți biofizice excepționale (Vincke et al., 2009).

Pentru a evalua potențiala utilizare a VHH FC5 al camelidelor ca purtător BBB în cadrul anticorpilor bispecifici care țintesc SNC, au fost proiectate și evaluate in vitro și in vivo fuziuni monovalente și bivalente (N- și C-terminal) ale FC5 cu Fc uman (Farrington et al., 2014). Afinitatea aparentă de legare (Kdapp) la BEC de șobolan a fuziunii FC5Fc bivalente a fost de 75 nM, în timp ce legarea FC5Fc monovalente a fost în intervalul micromolar. Analizele ratelor aparente de transmigrație (Papp) prin intermediul unui model BBB in vitro, expunerea aparentă la nivelul SNC derivată din farmacocinetica serică/CSF a construcțiilor de anticorpi administrate pe cale sistemică și răspunsurile farmacologice provocate de peptide neuroactive impermeabile la nivelul BBB conjugate chimic în modelul de durere Hargreaves, au furnizat dovezile unui transport BBB îmbunătățit al acestor molecule de anticorpi mari (75 kDa) mediat de FC5: (1) valorile Papp in vitro au fost de ~ 200 cm/min pentru ambele molecule mono- și bivalente de fuziune Fc N-terminal (FC5Fc), comparativ cu 4-8 cm/min pentru VHH A20 de control.1Fc sau fuziunile EG2Fc; (2) expunerea aparentă la SNC a fuziunii FC5Fc a fost de 30 de ori mai mare comparativ cu fuziunile anticorp-Fc cu domeniu de control; (3) potența farmacologică sistemică a conjugatelor FC5Fc cu neuropeptidele dalargin sau galanin în modelul de durere inflamatorie Hargreaves au fost de până la 60 de ori mai mari comparativ cu conjugatele FC5-neuropeptide monomerice. Acest rezultat a fost atribuit timpului de înjumătățire circulatorie lung (~ 96 h) al FC5Fc- comparativ cu conjugatele FC5-neuropeptide; (4) diferiți neuropeptide neuropeptide conjugate VHH-Fc de control nu au prezentat eficacitate sistemică; (5) fuziunea FC5 la extremitatea C-terminală a Fc a dus la o capacitate atenuată de traversare a BBB. Spre deosebire de anticorpii purtători de BBB care țintesc TfR, ambele proteine de fuziune FC5Fc mono- și bivalente au prezentat o rată similară de transcitoză in vitro, profiluri farmacocinetice plasmatice/CSF similare și o potență sistemică similară în modelul farmacodinamic in vivo, în ciuda diferențelor în ceea ce privește afinitatea și valența aparentă de legare (Farrington et al., 2014). Aceste studii au demonstrat că anticorpul FC5 cu un singur domeniu care traversează BBB poate fi utilizat ca platformă de transport BBB atât ca „semicorp” heterodimerizat, cât și ca fuziune bi- sau tetravalentă mai ușor de scalat cu IgG-uri convenționale (Farrington et al, 2014).

Un alt avantaj potențial al VHH-urilor ca purtători BBB este rezistența lor naturală la provocări biofizice extreme, cum ar fi temperatura și pH-ul, precum și la degradarea proteazei (Kim et al., 2014), întâlnite adesea în diferite compartimente endocitare în timpul transcitozei. Atât fuziunile FC5, cât și FC5Fc sunt internalizate în BEC prin intermediul veziculelor acoperite cu clatrină și sunt sortate în endosomi timpurii. În mod interesant, s-a constatat, de asemenea, că FC5 stimulează eliminarea microveziculelor extracelulare (exosomi) din BEC (Haqqani, Caram-Salas, et al., 2013; Haqqani, Delaney, et al., 2013), în care atât FC5, cât și nivelurile crescute ale receptorului său putativ Cdc50A au fost detectate prin Western blot și spectrometrie de masă direcționată. Acest studiu a sugerat că exozomii vărsați pot fi vezicula finală a căii RMT eliberată de pe suprafața abluminală care transportă complexul receptor-anticorp (prezentat schematic în Fig. 4). Calea RMT și formarea exozomilor au în comun unele asemănări notabile. Așa cum s-a subliniat în prima descoperire a exozomilor, un anticorp anti-TfR a fost urmărit prin microscopie electronică în reticulocite (Théry, 2011) de la suprafața celulelor, în gropile acoperite cu clatrină, în interiorul endosomilor timpurii, pe suprafața veziculelor interne ale endosomilor multivesiculare și, în cele din urmă, pe exozomii eliberați după fuziunea endosomilor multivesiculare cu membrana plasmatică (Fig. 4). RMT pare să se desfășoare într-un mod similar și s-a demonstrat că microveziculele extracelulare BEC conțin mai mulți receptori cunoscuți pentru a transporta macromoleculele prin BHE prin RMT, inclusiv TfR, LRPs, LDLR și IR (Haqqani, Delaney, et al., 2013).

Din studiile descrise, ar trebui să fie evident că brațul purtător BBB al bsAb-urilor care țintesc SNC necesită o optimizare atentă pentru fiecare receptor RMT. Considerații importante în proiectarea bsAb-urilor care țintesc SNC sunt discutate mai jos, având în vedere „lecțiile învățate” din dezvoltarea bsAb-ului TfR-BACE1 și din propria noastră activitate cu FC5 ca anticorp purtător BBB.

.

Leave a Reply

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.