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Símbolo de Gene: RNASE1

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1. Geral

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A ribonuclease pancreática também conhecida como ribonuclease A (RNase A) ou ribonuclease 1 (RNase1) é uma enzima que catalisa a decomposição do RNA e tem um papel na digestão do RNA em espécies vertebradas. Os primeiros trabalhos focaram no RNase pancreático bovino devido à grande quantidade presente no pâncreas. Tem sido descrita como a enzima mais bem estudada do século XX, com quatro prêmios Nobel concedidos para estudos desta proteína (20). Devido aos altos níveis presentes no pâncreas bovino, a RNase1 foi historicamente considerada como uma enzima digestiva, mas com pouca utilidade em humanos e outros mamíferos não ruminantes (2) onde existe em concentrações muito mais baixas. Entretanto, a digestão do RNA ocorre no intestino de todas as espécies e o RNase1 e outros membros de sua superfamília são agora conhecidos por terem funções adicionais na defesa do hospedeiro que serão discutidas mais tarde.

Estrutura e Mecanismo de Ação

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O RNase1 bovino foi purificado e cristalizado por Kunitz em 1939 (16) e sequenciado por Smyth, Stein e Moore em 1963 (30). Ele contém 124 aminoácidos, um peso molecular calculado de 13.683 e um excesso de resíduos básicos levando a um ponto isoelétrico de 8,5 – 9,0. Contém quatro ligações de dissulfeto e tem sido usado como modelo para estudar a dobragem de proteínas (22). Também é glicosilada em resíduos de asparagina com a forma glicosilada originalmente denominada RNase B. Devido à glicosilação e à estrutura terciária, ela funciona na maioria dos géis SDS a 18 ou 19 kDa. O RNase suíno 1 contém 125 aminoácidos (26); o RNase humano 1 contém 3 aminoácidos adicionais no terminal carboxil do que o RNase bovino1 (4). O RNase1 bovino foi a primeira enzima a ter sua estrutura tridimensional determinada. Ele tem uma forma geral como um feijão renal com o local ativo na fenda contendo His12, His119, e Lys41 (25). Outros sítios não-catalíticos de ligação ajudam a enzima a formar um complexo com o seu substrato polimérico. O RNase1 catalisa a hidrólise de ligações de 3′,5′-fosfodiester em RNA isolado quando a base do lado de 3′ é uma pirimidina (7, 11, 23). O processo é normalmente representado como ocorrendo em duas etapas, com a primeira etapa envolvendo a formação de um fosfodiéster cíclico e a segunda, a hidrólise (23). O RNase 1 não hidrolisa o DNA por falta de um grupo de 2′-OH. Isso permite que ele seja usado para remover a contaminação por RNA do DNA. Também é utilizado em ensaios de protecção de ribonuclease. O RNase 1 forma dímeros através da troca de domínio de amino terminados pela formação de ligações sulfidrílicas, de forma a manter cada local ativo (18). Enquanto mantém a função hidrolítica os dímeros adquirem uma atividade biológica adicional com dímeros, trimers e tetrâmeros possuindo atividade antitumoral

Ribonuclease A Superfamily

Os códigos do genoma humano para 122 ribonucleases separadas. A RNAse A superfamily consiste em oito ribonucleases “canônicas” com atividade enzimática e homologia estrutural ao RNase A (15). Todas são proteínas secretoras que compartilham uma estrutura terciária ligada ao dissulfeto e são capazes de degradar o RNA. Todas são codificadas em uma região apertada do cromossomo 14 tanto em humanos quanto em camundongos (27) e acredita-se que tiveram origem na duplicação de genes (3, 31). Embora o gene contenha vários exons, a região codificadora é contribuída por um único exon. O entendimento do seu papel fisiológico é incompleto, mas a maioria é importante para a defesa e angiogênese do hospedeiro, assim como para a digestão (9). O primeiro membro a ser descrito é a RNase 1 que além de ser uma enzima pancreática é produzida em uma variedade de células, incluindo células endoteliais vasculares, onde após a secreção degrada o RNA polimérico vascular e tem atividade anti-HIV-1 (15). RNase 2 e 3 são proteínas secretoras de eosinófilos chamadas neurotoxinas derivadas de eosinófilos (EDN) e proteína catiônica de eosinófilos (ECP), respectivamente (15). A RNase 4 está presente em múltiplos tecidos, mas o seu papel fisiológico não é claro. A RNase 5, também conhecida como angiogenina, induz o crescimento dos vasos sanguíneos (10). A RNase 7 é a RNase mais abundante na pele enquanto a RNase 8 é expressa na placenta (15). Genes adicionais no grupo estão relacionados com ribonucleases (RNase 9 a 13), mas suas proteínas têm mutações que impedem a atividade da RNase. Algumas das RNases segregadas ou seus oligómeros podem entrar nas células e exercer efeitos citotóxicos especialmente nas células tumorais.

Inibidor de ribonuclease

Inibidor de ribonuclease mamífero (RI) é uma proteína citosólica de 50 KDa que se liga com alta afinidade e estoquiometria 1:1 à ribonuclease pancreática, inactivando-a (8, 17). É particularmente abundante na placenta e no fígado e tem sido usada para purificar a RNase. Ela inibe todos os membros da família RNase A. A sua estrutura tridimensional é a de uma ferradura que contém repetições ricas em leucina. Embora o papel biológico não seja claro, deve ligar e inactivar qualquer RNase A membro da família RNase A escapando do caminho secreto e entrando no citoplasma.

2. Papel da libertação de ribonucleótidos no pâncreas

A maioria das células contém concentrações milimolares de ribonucleótidos mas apenas concentrações micromolares de desoxirribonucleótidos (5). Assim, a dieta contém uma mistura de ribonucleoproteínas, RNA e ribonucleotídeos. As nucleoproteínas são decompostas por protease pancreática. A visão do livro de texto é que ácidos nucléicos dietéticos são quebrados por RNase pancreática e DNase no intestino. Um estudo recente, entretanto, mostrou que a pepsina no estômago também hidrolisa o ácido nucléico, então esta digestão começa lá (19). Alimentos ricos em ribonucleoproteínas incluem carnes de órgãos, frutos do mar e legumes (5).

RNase pancreática (RNase 1) está presente em todos os pâncreas vertebrados, mas a quantidade varia muito (2). Mamíferos com grandes quantidades incluem ungulados, roedores e marsupiais herbívoros. Na vaca, o RNase compõe 20% da enzima digestiva; esta exigência é pensada devido à grande carga de RNA que é produzida pelas bactérias a partir da fermentação ruminal. Em outras espécies incluindo humanos, cães, gatos e vertebrados inferiores, o RNase está presente em quantidades muito menores e pode representar apenas 0,5 a 1% das enzimas pancreáticas. Embora existam poucos estudos, a RNase pancreática em todas as espécies parece quebrar o ácido nucleico da dieta no lúmen intestinal para os nucleotídeos, que são ainda quebrados pela fosfatase alcalina intestinal e pela 5’nucleotidase para os nucleotídeos e bases nitrogenadas livres. Portanto, a digestão dos ácidos nucléicos tem uma fase luminal e uma fase de borda de escova. Estes produtos são absorvidos por enterócitos mas a maioria é excretada na urina; alguns são usados para ressíntese principalmente no estado de jejum (13, 21, 29). Normalmente 80 a 90% dos nucleotídeos são absorvidos e estes podem tornar-se essenciais em certas doenças ou períodos de ingestão limitada ou crescimento rápido (5).

Ribonuclease é sintetizada em células acinares por ER rugosas, dobradas e embaladas em grânulos de zymogen a partir dos 20 dias de gestação no rato (33). A dobra ocorre muito mais rapidamente nas células do que na proteína isolada e, exceto por uma pequena quantidade de dímeros, qualquer proteína que não termine como um monômero dobrado é degradada (12). Ela é secretada no meio paralelamente a outras enzimas digestivas por lobos pancreáticos e acini estimulados com CCK ou análogos colinérgicos (14, 24, 28). A síntese da RNase 1 é reduzida em 50% na diabetes experimental, mas muito menos que a diminuição da amilase.

3. Ferramentas para o estudo da Ribonuclease1

a. Anticorpos

Biocompare (www.biocompare.com) lista 394 anticorpos de ribonuclease de 32 fornecedores. Alguns são específicos da espécie enquanto outros são específicos para o RNase1 ou outros membros da família. Não testamos nenhum destes anticorpos.

b. Atividade de ribonuclease

Atividade de ribonuclease primária utilizada a hidrólise do RNA da levedura; utilizamos um ensaio descrito por Anfinsen (1) para medir a secreção de ribonuclease pancreática por acini pancreática de rato isolado (24). Estes ensaios, entretanto, não são específicos para o RNase1 e funcionaram para o estudo da secreção de acinar pancreático porque o RNase1 é a principal forma presente no acini pancreático. Um ensaio também foi descrito usando a hidrólise da cittidina 2′-3′-fosfato (6). Recentemente foi desenvolvido um ensaio de fluorescência quantitativa baseado na ligação do brometo de etídio ao RNA da levedura (32).

4. Referências

1. Anfinsen CB, Redfield RR, Choate WL, Page J, e Carroll WR. Estudos sobre a estrutura bruta, ligações cruzadas e sequências de terminais em ribonuclease. J Biol Chem 207: 201-210, 1954. PMID: 13152095
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3. Beintema JJ, e Kleineidam RG. O ribonuclease Uma superfamília: discussão geral. Cell Mol Life Sci 54: 825-832, 1998. PMID: 9760991
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