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4.3 BBB-crossing bsAbs engineered with single-domain antibodies

sdAbs are small (15 kDa), monomeric antigen-binding fragments of antibodies which provide various advantages over other antibody fragments as “building blocks” for bsAbs. Eles ocorrem na natureza como a porção ligadora de antígenos de anticorpos de cadeia pesada em espécies de camelídeos (chamados VHH) e peixes cartilaginosos (chamados VNAR) ou podem ser gerados a partir de IgGs convencionais através da obtenção ou engenharia de domínios monoméricos, estáveis em VH ou VL (Hamers-Casterman et al., 1993; Hussack et al., 2012; Kim et al, 2014; Nuttall, 2012; Ward, Güssow, Griffiths, Jones, & Winter, 1989). sdAbs são altamente estáveis e compactos e podem acessar epitopos encastrados em proteínas, como cavidades receptoras ou os locais ativos das enzimas, que são freqüentemente “escondidos” dos IgGs convencionais e podem atingir afinidades de ligação com alvos comparáveis aos dos anticorpos convencionais (Lauwereys et al., 1998; Staus et al., 2014). Essas unidades monoméricas de ligação de antígenos não se emparelham com cadeias leves, o que as torna excelentes blocos de construção para bsAbs heterodimerizados, pois evitam dificuldades de emparelhamento inadequado da cadeia de luz (Hamers-Casterman et al., 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). Os bsAbs heterodiméricos podem ser criados com um ou ambos os “braços” sendo sdAb, sendo este último semelhante em estrutura aos anticorpos camelídeos de cadeia pesada (Fig. 3E). sdAbs também pode ser usado em várias fusões mono, bi-, ou tetravalentes com anticorpos terapêuticos convencionais ou Fabs (Fig. 3E). 3E), geralmente resultando em moléculas menores e menos complexas, em comparação com aquelas geradas com scFvs ou Fabs como blocos de construção, que tendem a ser biofisicamente bem comportadas e fáceis de produzir (Holliger & Hudson, 2005). A humanização de VHHs, bem como a engenharia de sdAbs é bem descrita, permitindo gerar prontamente sdAbs humanos(ized) com ótima afinidade ao alvo e propriedades biofísicas excepcionais (Vincke et al, 2009).

Para avaliar o uso potencial do camelídeo VHH FC5 como um portador de BBB dentro de anticorpos bi-específicos para o SNC, fusões monovalentes e bivalentes (N- e C-terminus) do FC5 com Fc humano foram projetadas e avaliadas in vitro e in vivo (Farrington et al., 2014). A afinidade aparente de ligação (Kdapp) com BEC de rato da fusão bivalente do FC5Fc foi de 75 nM, enquanto que a ligação monovalente do FC5Fc estava na faixa micromolar. A análise das taxas de transmigração aparente (Papp) através de um modelo BBB in vitro, exposição aparente do SNC derivada da farmacocinética sérica/CSF de construções de anticorpos administrados sistemicamente, e respostas farmacológicas obtidas por peptídeos neuroativos conjugados quimicamente com BBB no modelo de dor Hargreaves, forneceu a evidência de transporte melhorado de BBB dessas moléculas de anticorpos grandes (75 kDa) mediadas pelo FC5: (1) os valores de Papp in vitro foram de ~ 200 cm/min para moléculas de fusão Fc mono e N-terminal bivalente (FC5Fc) comparados com 4-8 cm/min para controle VHH A20.1Fc ou EG2Fc fusões; (2) a exposição aparente do SNC à fusão FC5Fc foi 30 vezes maior quando comparada às fusões controle anti-corpo-fc; (3) a potência farmacológica sistêmica dos conjugados FC5Fc com neuropeptídeos dalargin ou galanina no modelo de dor inflamatória Hargreaves foi até 60 vezes maior quando comparada aos conjugados monoméricos FC5-neuropeptídeos. Este resultado foi atribuído à longa meia-vida circulatória (~ 96 h) do FC5-fc- comparado aos conjugados FC5-neuropéptidos; (4) vários conjugados neuropéptidos controle VHH-Fc não mostraram eficácia sistêmica; (5) a fusão do FC5 com o C-terminus de Fc resultou na atenuação da capacidade de cruzamento do BBB. Em contraste com os anticorpos TfR que visam o BBB-carrier, as proteínas de fusão mono e bivalente FC5Fc mostraram uma taxa semelhante de transcitose in vitro, perfis farmacocinéticos plasmáticos/CSF semelhantes e potência sistêmica semelhante no modelo farmacodinâmico in vivo, apesar das diferenças de afinidade e valência de ligação aparente (Farrington et al., 2014). Esses estudos demonstraram que o anticorpo FC5 de um único domínio, o BBB-crossing FC5, pode ser usado como um transportador de plataforma BBB em ambos, heterodimerizados “meio-anticorpos” e como a fusão bi- ou tetravalente mais facilmente escalável aos IgGs convencionais (Farrington et al, 2014).

Outra vantagem potencial dos VHHs como portadores do BBB é a sua resistência natural a desafios biofísicos extremos, como temperatura e pH, bem como à degradação da protease (Kim et al., 2014), frequentemente encontrada em vários compartimentos endocíticos durante a transcitose. As fusões FC5 e FC5Fc são internalizadas em BEC através de vesículas revestidas de clatrina, e são classificadas para endossomos iniciais. Curiosamente, o FC5 também foi encontrado para estimular o desprendimento de microvesículas extracelulares (exossomos) de BEC (Haqqani, Caram-Salas, et al., 2013; Haqqani, Delaney, et al., 2013) nos quais tanto o FC5 quanto o aumento dos níveis de seu receptor putativo Cdc50A foram detectados por Western blot e espectrometria de massa direcionada. Este estudo sugeriu que os exossomos derramados podem ser a vesícula final da via RMT liberada da superfície abluminal que carrega o complexo receptor-anticorpo (esquematicamente mostrado na Fig. 4). A via do RMT e a formação dos exossomos compartilham algumas semelhanças notáveis. Como descrito na primeira descoberta de exossomos, um anticorpo anti-TfR foi rastreado por microscopia eletrônica em reticulócitos (Théry, 2011) a partir da superfície das células, em fossos revestidos de clatrina, dentro de endossomos iniciais, na superfície de vesículas internas de endossomos multiviculares e finalmente nos exossomos liberados após a fusão dos endossomos multiviculares com a membrana plasmática (Fig. 4). O RMT parece desdobrar-se de forma semelhante e os microvesículos extracelulares BEC parecem conter vários receptores conhecidos por transportar macromoléculas através do BBB via RMT, incluindo TfR, LRPs, LDLR e IR (Haqqani, Delaney, et al., 2013).

Dos estudos descritos, deve ser evidente que o braço portador do BBB do bsAb para o SNC requer uma otimização cuidadosa para cada receptor RMT. Considerações importantes no projeto do bsAbs de direcionamento do SNC são discutidas abaixo, em vista das “lições aprendidas” do desenvolvimento do TfR-BACE1 bsAb e do nosso próprio trabalho com o FC5 como um anticorpo portador do BBB.

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