Pancreapedia

Symbol genu: RNASE1

1. General

Rybonukleaza trzustkowa znana również jako rybonukleaza A (RNase A) lub rybonukleaza 1 (RNase1) jest enzymem, który katalizuje rozkład RNA i odgrywa rolę w trawieniu RNA u kręgowców. Wczesne prace skupiały się na bydlęcej RNazie trzustkowej ze względu na jej dużą ilość obecną w trzustce. Została ona opisana jako najlepiej zbadany enzym XX wieku z czterema nagrodami Nobla przyznanymi za badania nad tym białkiem (20). Ze względu na wysoki poziom obecny w trzustce bydlęcej, RNaza1 była historycznie uważana za enzym trawienny, ale z niewielkim przeznaczeniem u ludzi i innych ssaków nieprzeżuwających (2), gdzie występuje w znacznie niższych stężeniach. Jednakże trawienie RNA zachodzi w jelitach wszystkich gatunków, a RNaza1 i inni członkowie jej nadrodziny są obecnie znani z dodatkowych funkcji w obronie gospodarza, które zostaną omówione później.

Struktura i mechanizm działania

Krowia RNaza1 została oczyszczona i skrystalizowana przez Kunitza w 1939 r. (16) i zsekwencjonowana przez Smytha, Steina i Moore’a w 1963 r. (30). Zawiera 124 aminokwasy, obliczoną masę cząsteczkową 13,683 i nadmiar reszt zasadowych, co prowadzi do punktu izoelektrycznego 8,5 – 9,0. Zawiera cztery wiązania disulfidowe i była używana jako model do badania fałdowania białek (22). Jest również glikozylowana na resztach asparaginowych, a jej glikozylowana forma pierwotnie nazywana była RNazą B. Ze względu na glikozylację i strukturę trzeciorzędową, w większości żeli SDS jej masa wynosi 18 lub 19 kDa. RNaza świńska 1 zawiera 125 aminokwasów (26); ludzka RNaza 1 zawiera 3 dodatkowe aminokwasy na terminalu karboksylowym niż bydlęca RNaza1 (4). Bydlęca RNaza1 była pierwszym enzymem, którego struktura trójwymiarowa została określona. Ma ona ogólny kształt przypominający fasolkę nerkowatą z miejscem aktywnym w szczelinie zawierającym His12, His119 i Lys41 (25). Inne niekatalityczne miejsca wiążące pomagają enzymowi tworzyć kompleks z jego polimerycznym substratem. RNaza1 katalizuje hydrolizę wiązań 3′,5′-fosfodiestrowych w jednoniciowym RNA, gdy zasadą po stronie 3′ jest pirymidyna (7, 11, 23). Proces ten jest zwykle przedstawiany jako przebiegający w dwóch etapach, z których pierwszy obejmuje tworzenie cyklicznego fosfodiestru, a drugi jego hydrolizę (23). RNaza 1 nie hydrolizuje DNA, ponieważ nie posiada grupy 2′-OH. Dzięki temu może być wykorzystywana do usuwania zanieczyszczeń RNA z DNA. Jest również wykorzystywana w testach ochrony przed rybonukleazą. RNaza 1 tworzy dimery poprzez zamianę domen termininów aminowych w wyniku tworzenia wiązań sulfhydrylowych w taki sposób, aby każde miejsce aktywne pozostało aktywne (18). Zachowując funkcję hydrolityczną, dimery uzyskują dodatkową aktywność biologiczną z dimerami, trymerami i tetramerami posiadającymi aktywność przeciwnowotworową

Nadrodzina rybonukleaz A

Ludzki genom koduje 122 oddzielne rybonukleazy. Nadrodzina RNAse A składa się z ośmiu „kanonicznych” rybonukleaz o aktywności enzymatycznej i strukturalnej homologii do RNase A (15). Wszystkie są białkami wydzielniczymi, które mają wspólną strukturę trzeciorzędową z wiązaniami disiarczkowymi i są zdolne do degradacji RNA. Wszystkie są kodowane w ciasnym regionie chromosomu 14 zarówno u ludzi, jak i u myszy (27) i uważa się, że powstały w wyniku duplikacji genu (3, 31). Chociaż gen zawiera kilka eksonów, region kodujący jest tworzony przez pojedynczy ekson. Zrozumienie ich fizjologicznej roli jest niepełne, ale większość z nich jest ważna dla obrony gospodarza i angiogenezy, jak również dla trawienia (9). Pierwszym opisanym członkiem jest RNaza 1, która oprócz tego, że jest enzymem trzustkowym, jest produkowana w różnych komórkach, w tym w komórkach śródbłonka naczyniowego, gdzie po wydzieleniu degraduje naczyniowy polimeryczny RNA i ma aktywność anty-HIV-1 (15). RNaza 2 i 3 są białkami wydzielanymi przez eozynofile, określanymi odpowiednio jako eozynofilowa neurotoksyna (EDN) i eozynofilowe białko kationowe (ECP) (15). RNaza 4 jest obecna w wielu tkankach, ale jej fizjologiczna rola jest niejasna. RNaza 5, znana również jako angiogenina, indukuje wzrost naczyń krwionośnych (10). RNaza 7 jest najliczniej występującą RNazą w skórze, podczas gdy RNaza 8 ulega ekspresji w łożysku (15). Dodatkowe geny w klastrze są związane z rybonukleazami (RNaza 9 do 13), ale ich białka mają mutacje uniemożliwiające aktywność RNaz. Niektóre z wydzielanych RNaz lub ich oligomery mogą wnikać do komórek i wywierać działanie cytotoksyczne, zwłaszcza na komórki nowotworowe.

Inhibitor rybonukleazy

Inhibitor rybonukleazy ssaków (RI) jest cytozolowym białkiem o masie 50 KDa, które wiąże się z wysokim powinowactwem i stechiometrią 1:1 z rybonukleazą trzustkową, unieczynniając ją (8, 17). Jest ona szczególnie obficie występująca w łożysku i wątrobie i była używana do oczyszczania RNazy. Hamuje wszystkich członków rodziny RNaz A. Jej trójwymiarowa struktura jest strukturą podkowy, która zawiera powtórzenia bogate w leucynę. Chociaż rola biologiczna nie jest jasne, że powinien wiązać i inaktywować każdy członek rodziny RNase A uciekając szlak wydzielniczy i wejście do cytoplazmy.

2. Rola rybonukleazy w trzustce

Większość komórek zawiera milimolarne stężenia rybonukleotydów, ale tylko mikromolarne stężenia deoksyrybonukleotydów (5). Tak więc dieta zawiera mieszaninę rybonukleoprotein, RNA i rybonukleotydów. Nukleoproteiny są rozkładane przez proteazy trzustkowej. Podręcznikowy pogląd jest, że kwasy nukleinowe diety są rozkładane przez RNase trzustki i DNase w jelicie. Ostatnie badania wykazały jednak, że pepsyna w żołądku również hydrolizuje kwas nukleinowy, więc trawienie zaczyna się właśnie tam (19). Pokarmy bogate w rybonukleoproteiny obejmują mięsa organiczne, owoce morza i rośliny strączkowe (5).

RNaza trzustkowa (RNaza 1) jest obecna we wszystkich trzustkach kręgowców, ale jej ilość jest bardzo zróżnicowana (2). Ssaki, u których występuje w dużych ilościach to kopytne, gryzonie i roślinożerne marsupiale. U krów RNaza stanowi 20% enzymu trawiennego; uważa się, że wymóg ten wynika z dużego obciążenia RNA, które jest wytwarzane przez bakterie w procesie fermentacji żwaczowej. U innych gatunków, w tym u ludzi, psów, kotów i niższych kręgowców, RNaza jest obecna w znacznie mniejszych ilościach i może stanowić jedynie 0,5 do 1% enzymów trzustkowych. Chociaż istnieje tylko kilka badań, RNaza trzustkowa u wszystkich gatunków wydaje się rozkładać kwas nukleinowy w świetle jelita do nukleotydów, które są dalej rozkładane przez jelitową fosfatazę alkaliczną i 5’nukleotydazę do nukleozydów i wolnych zasad azotowych. Trawienie kwasów nukleinowych ma zatem fazę luminalną i fazę na granicy szczoteczek. Produkty te są wchłaniane przez enterocyty, ale większość jest wydalana z moczem; niektóre są wykorzystywane do resyntezy głównie na czczo (13, 21, 29). Normalnie 80 do 90% nukleotydów jest wchłanianych i mogą one stać się niezbędne w niektórych chorobach lub w okresach ograniczonego spożycia lub szybkiego wzrostu (5).

Rybonukleaza jest syntetyzowana w komórkach akarylarnych przez szorstki ER, składana i pakowana do granulek zymogenu począwszy od 20 dnia ciąży u szczura (33). Składanie zachodzi znacznie szybciej w komórkach w porównaniu do izolowanego białka i z wyjątkiem niewielkiej ilości dimeru każde białko nie zakończone jako złożony monomer ulega degradacji (12). Jest ona wydzielana do medium równolegle z innymi enzymami trawiennymi przez zraziki i żoł±dki trzustki stymulowane CCK lub analogami cholinergicznymi (14, 24, 28). Synteza RNazy 1 jest zmniejszona w cukrzycy doświadczalnej o 50%, ale znacznie mniej niż spadek dla amylazy.

3. Narzędzia do badania Ribonukleazy1

a. Przeciwciała

Biocompare (www.biocompare.com) wymienia 394 przeciwciała rybonukleazy od 32 dostawców. Niektóre z nich są specyficzne dla gatunku, podczas gdy inne są specyficzne dla RNase1 lub innych członków rodziny. Nie testowaliśmy żadnego z tych przeciwciał.

b. Aktywność rybonukleazy

Wczesne testy rybonukleazy wykorzystywały hydrolizę drożdżowego RNA; użyliśmy testu opisanego przez Anfinsena (1) do pomiaru wydzielania rybonukleazy trzustkowej przez izolowane szczurze acini trzustki (24). Testy te nie są jednak specyficzne dla RNazy1 i sprawdziły się w badaniach wydzielania z pęcherzyków trzustkowych, ponieważ RNaza1 jest główną formą obecną w pęcherzykach trzustkowych. Opisano również test wykorzystujący hydrolizę 2′-3′-fosforanu cytydyny (6). Ostatnio opracowano ilościowy test fluorescencyjny oparty na wiązaniu bromku etydyny z drożdżowym RNA (32).

4. Referencje

  1. Anfinsen CB, Redfield RR, Choate WL, Page J, and Carroll WR. Studies on the gross structure, cross-linkages, and terminal sequences in ribonuclease. J Biol Chem 207: 201-210, 1954. PMID: 13152095
  2. Barnard EA. Biological function of pancreatic ribonuclease. Nature 221: 340-344, 1969. PMID: 4974403
  3. Beintema JJ, and Kleineidam RG. The ribonuclease A superfamily: general discussion. Cell Mol Life Sci 54: 825-832, 1998. PMID: 9760991
  4. Beintema JJ, Wietzes P, Weickmann JL, and Glitz DG. The amino acid sequence of human pancreatic ribonuclease. Anal Biochem 136: 48-64, 1984. PMID: 6201087
  5. Carver JD, and Walker, WA. Rola nukleotydów w żywieniu człowieka. J Nutr Biochem 6: 58 – 72, 1995.
  6. Crook EM, Mathias AP, and Rabin BR. Spektrofotometryczne oznaczenie bydlęcej trzustki ribonuclease przez wykorzystanie 2′:3′-fosforanu cytydyny. Biochem J 74: 234-238, 1960. PMID: 13812977
  7. Cuchillo CM, Nogues MV, and Raines RT. Bovine pancreatic ribonuclease: pięćdziesiąt lat pierwszego mechanizmu reakcji enzymatycznej. Biochemistry 50: 7835-7841, 2011. PMID: 21838247
  8. Dickson KA, Haigis MC, and Raines RT. Ribonuclease inhibitor: struktura i funkcja. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 80: 349-374, 2005. PMID: 16164979
  9. Dyer KD, and Rosenberg HF. The RNase a superfamily: generation of diversity and innate host defense. Mol Divers 10: 585-597, 2006. PMID: 16969722
  10. Fett JW, Strydom DJ, Lobb RR, Alderman EM, Bethune JL, Riordan JF, and Vallee BL. Isolation and characterization of angiogenin, angiogenic protein from human carcinoma cells. Biochemistry 24: 5480-5486, 1985. PMID: 4074709
  11. Findlay D, Herries DG, Mathias AP, Rabin BR, and Ross CA. The active site and mechanism of action of bovine pancreatic ribonuclease. Nature 190: 781-784, 1961. PMID: 13699542
  12. Geiger R, Gautschi M, Thor F, Hayer A, and Helenius A. Folding, quality control, and secretion of pancreatic ribonuclease in live cells. J Biol Chem 286: 5813-5822, 2011. PMID: 21156800
  13. Ho CY, Miller KV, Savaiano DA, Crane RT, Ericson KA, and Clifford AJ. Absorption and metabolism of orally administered purines in fed and fasted rats. J Nutr 109: 1377-1382, 1979. PMID: 458492
  14. Iwanij V, and Jamieson JD. Biochemiczna analiza białek wydzielniczych syntetyzowanych przez normalne trzustki szczura i przez komórki nowotworowe acinar trzustki. J Cell Biol 95: 734-741, 1982. PMID: 6185502
  15. Koczera P, Martin L, Marx G, and Schuerholz T. The Ribonuclease A Superfamily in Humans: Canonical RNases as the Buttress of Innate Immunity. Int J Mol Sci 17: 2016. PMID: 27527162
  16. Kunitz M. Crystalline Ribonuclease. J Gen Physiol 24: 15-32, 1940. PMID: 19873197
  17. Lee FS, and Vallee BL. Structure and action of mammalian ribonuclease (angiogenin) inhibitor. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 44: 1-30, 1993. PMID: 8434120
  18. Libonati M. Biological actions of the oligomers of ribonuclease A. Cell Mol Life Sci 61: 2431-2436, 2004. PMID: 15526151
  19. Liu Y, Zhang Y, Dong P, An R, Xue C, Ge Y, Wei L, and Liang X. Digestion of Nucleic Acids Starts in the Stomach. Sci Rep 5: 11936, 2015. PMID: 26168909
  20. Marshall GR, Feng JA, and Kuster DJ. Back to the future: ribonuclease A. Biopolymers 90: 259-277, 2008. PMID: 17868092
  21. McAllan AB. Degradacja kwasów nukleinowych w, i usuwanie produktów rozpadu z jelita cienkiego wołów. Br J Nutr 44: 99-112, 1980. PMID: 6158999
  22. Moore S, i Stein WH. Struktury chemiczne trzustki ribonuclease i deoxyribonuclease. Science 180: 458-464, 1973. PMID: 4573392
  23. Nogues MV, Vilanova M, and Cuchillo CM. Bovine pancreatic ribonuclease A jako model enzymu z wielu miejsc wiązania substratów. Biochim Biophys Acta 1253: 16-24, 1995. PMID: 7492594
  24. Otsuki M, and Williams JA. Effect of diabetes mellitus on the regulation of enzyme secretion by isolated rat pancreatic acini. J Clin Invest 70: 148-156, 1982. PMID: 6177717
  25. Raines RT. Ribonuclease A. Chem Rev 98: 1045-1066, 1998.
  26. Reinhold VN, Dunne FT, Wriston JC, Schwarz M, Sarda L, and Hirs CH. The isolation of porcine ribonuclease, a glycoprotein, from pancreatic juice. J Biol Chem 243: 6482-6494, 1968. PMID: 5715511
  27. Samuelson LC, Wiebauer K, Howard G, Schmid RM, Koeplin D, and Meisler MH. Isolation of the murine ribonuclease gene Rib-1: structure and tissue specific expression in pancreas and parotid gland. Nucleic Acids Res 19: 6935-6941, 1991. PMID: 1840677
  28. Scheele GA, and Palade GE. Studies on the guinea pig pancreas. Równoległe wydzielanie aktywności enzymów egzokrynnych. J Biol Chem 250: 2660-2670, 1975. PMID: 1123325
  29. Schwenk M, Hegazy E, and Lopez del Pino V. Uridine wychwyt przez izolowane komórki nabłonka jelitowego świnki morskiej. Biochim Biophys Acta 805: 370-374, 1984. PMID: 6210111
  30. Smyth DG, Stein WH, and Moore S. The sequence of amino acid residues in bovine pancreatic ribonuclease: revisions and confirmations. J Biol Chem 238: 227-234, 1963. PMID: 13989651
  31. Sorrentino S. The eight human „canonical” ribonucleases: molecular diversity, catalytic properties, and special biological actions of the enzyme proteins. FEBS Lett 584: 2194-2200, 2010. PMID: 20388512
  32. Tripathy DR, Dinda AK, and Dasgupta S. A simple assay for the ribonuclease activity of ribonucleases in the presence of ethidium bromide. Anal Biochem 437: 126-129, 2013. PMID: 23499964
  33. Van Nest GA, MacDonald RJ, Raman RK, and Rutter WJ. Proteins synthesized and secreted during rat pancreatic development. J Cell Biol 86: 784-794, 1980. PMID: 7410479

.

Leave a Reply

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.