Nanobody

4.3 BBB-crossing bsAbs engineered with single-domain antibodies

sdAbs są małymi (15 kDa), monomerycznymi, wiążącymi antygen fragmentami przeciwciał, które zapewniają różne korzyści w porównaniu z innymi fragmentami przeciwciał jako „bloki konstrukcyjne” dla bsAbs. Występują one w naturze jako część wiążąca antygen w łańcuchu ciężkim przeciwciał u gatunków wielbłądowatych (zwana VHH) i ryb chrzęstnoszkieletowych (zwana VNAR) lub mogą być generowane z konwencjonalnych IgG poprzez uzyskiwanie lub inżynierię monomerycznych, stabilnych domen VH lub VL (Hamers-Casterman i in., 1993; Hussack i in., 2012; Kim i in…, 2014; Nuttall, 2012; Ward, Güssow, Griffiths, Jones, & Winter, 1989). sdAbs są wysoce stabilne i zwarte oraz mogą uzyskać dostęp do zagłębionych epitopów w białkach, takich jak wnęki receptorów lub miejsca aktywne enzymów, które są często „ukryte” przed konwencjonalnymi IgG i mogą osiągnąć docelowe powinowactwo wiązania porównywalne z powinowactwem konwencjonalnych przeciwciał (Lauwereys i in., 1998; Staus i in., 2014). Te monomeryczne jednostki wiążące antygen nie parują się z łańcuchami lekkimi, co czyni je doskonałymi elementami budulcowymi dla heterodimerycznych bsAbs, ponieważ unikają trudności związanych z niewłaściwym parowaniem łańcuchów lekkich (Hamers-Casterman i in., 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). Heterodimeryczne bsAbs mogą być tworzone z jednym lub obydwoma „ramionami” będącymi sdAb, te ostatnie są podobne w strukturze do wielbłądzich przeciwciał o ciężkich łańcuchach (Rys. 3E). sdAbs mogą być również używane w różnych jedno-, dwu- lub tetrawalentnych fuzjach z konwencjonalnymi przeciwciałami terapeutycznymi lub Fabs (Rys. 3E). 3E), generalnie dając w rezultacie mniejsze, mniej złożone cząsteczki, w porównaniu do tych generowanych z scFvs lub Fabs jako bloków konstrukcyjnych, które zwykle dobrze zachowują się biofizycznie i są łatwe do wytworzenia (Holliger & Hudson, 2005). Humanizacja VHHs, jak również inżynieria sdAbs jest dobrze opisana, co pozwala na łatwe generowanie ludzkich sdAbs o optymalnym powinowactwie do celu i wyjątkowych właściwościach biofizycznych (Vincke i in., 2009).

Aby ocenić potencjalne zastosowanie wielbłądziego VHH FC5 jako nośnika BBB w obrębie bispecyficznych przeciwciał celujących do CNS, zaprojektowano i oceniono w warunkach in vitro i in vivo monowalentne i dwuwartościowe fuzje (N- i C-terminus) FC5 z ludzkim Fc (Farrington i in., 2014). Pozorne powinowactwo wiązania (Kdapp) do szczurzej BEC dwuwartościowej fuzji FC5Fc wynosiło 75 nM, podczas gdy wiązanie monowalentnej FC5Fc mieściło się w zakresie mikromolarnym. Analiza pozornych szybkości transmigracji (Papp) przez model BBB in vitro, pozornej ekspozycji OUN uzyskanej z farmakokinetyki surowicy/CSF konstruktów przeciwciał podawanych systemowo oraz odpowiedzi farmakologicznych wywołanych przez chemicznie skoniugowane, nieprzepuszczalne dla BBB neuroaktywne peptydy w modelu bólu Hargreavesa, dostarczyła dowodów na zwiększony transport BBB tych dużych (75 kDa) cząsteczek przeciwciał, w którym pośredniczy FC5: (1) wartości Papp in vitro wynosiły ~ 200 cm/min dla obu mono- i dwuwartościowych N-końcowych cząsteczek fuzyjnych Fc (FC5Fc) w porównaniu do 4-8 cm/min dla kontrolnych VHH A20.1Fc lub EG2Fc; (2) pozorna ekspozycja OUN dla fuzji FC5Fc była 30-krotnie wyższa w porównaniu z kontrolnymi fuzjami domeny przeciwciała-Fc; (3) ogólnoustrojowa siła farmakologiczna koniugatów FC5Fc z neuropeptydami dalarginą lub galaniną w modelu bólu zapalnego Hargreavesa była do 60 razy wyższa w porównaniu z monomerycznymi koniugatami FC5-neuropeptyd. Wynik ten przypisano długiemu okresowi półtrwania w krążeniu (~ 96 h) koniugatów FC5Fc- w porównaniu z koniugatami FC5-neuropeptydów; (4) różne kontrolne koniugaty neuropeptydów VHH-Fc nie wykazywały skuteczności ogólnoustrojowej; (5) fuzja FC5 z C-końcem Fc powodowała osłabienie zdolności do przekraczania BBB. W przeciwieństwie do przeciwciał TfR-targetujących nośnik BBB, zarówno jedno-, jak i dwuwartościowe białka fuzyjne FC5Fc wykazywały podobną szybkość transcytozy in vitro, podobne profile farmakokinetyczne w osoczu/CSF oraz podobną ogólnoustrojową siłę działania w modelu farmakodynamicznym in vivo, pomimo różnic w pozornym powinowactwie i walencji wiązania (Farrington i in., 2014). Badania te wykazały, że przechodzące przez BBB przeciwciało jednodomenowe FC5 może być stosowane jako platformowy nośnik BBB zarówno w postaci heterodimerycznych „półprzeciwciał”, jak i jako łatwiej skalowalna dwu- lub tetrawalentna fuzja do konwencjonalnych IgG (Farrington i in., 2014).

Inną potencjalną zaletą VHH jako nośników BBB jest ich naturalna odporność na ekstremalne wyzwania biofizyczne, takie jak temperatura i pH, a także na degradację proteaz (Kim i in., 2014), często spotykane w różnych przedziałach endocytarnych podczas transcytozy. Zarówno fuzje FC5, jak i FC5Fc są internalizowane do BEC przez pęcherzyki opłaszczone klatyną i są sortowane do wczesnych endosomów. Co ciekawe, stwierdzono również, że FC5 stymuluje wydalanie pozakomórkowych mikropęcherzyków (egzosomów) z BEC (Haqqani, Caram-Salas, et al., 2013; Haqqani, Delaney, et al., 2013), w których zarówno FC5, jak i zwiększone poziomy jego putatywnego receptora Cdc50A zostały wykryte za pomocą Western blot i ukierunkowanej spektrometrii mas. Badania te sugerowały, że zrzucane egzosomy mogą być końcową cząsteczką szlaku RMT uwalnianą z powierzchni abluminalnej, niosącą kompleks receptor-przeciwciało (schematycznie przedstawiono na ryc. 4). Szlak RMT i tworzenie egzosomów wykazują pewne istotne podobieństwa. Jak opisano w pierwszym odkryciu egzosomów, przeciwciało anty-TfR było śledzone za pomocą mikroskopii elektronowej w retikulocytach (Théry, 2011) z powierzchni komórek, do dołków pokrytych klatyną, wewnątrz wczesnych endosomów, na powierzchni wewnętrznych pęcherzyków endosomów wielopęcherzykowych i w końcu na uwolnionych egzosomach po fuzji endosomów wielopęcherzykowych z błoną plazmatyczną (ryc. 4). RMT wydaje się rozwijać w podobny sposób, a wykazano, że pozakomórkowe mikropęcherzyki BEC zawierają kilka receptorów, o których wiadomo, że przenoszą makrocząsteczki przez BBB za pośrednictwem RMT, w tym TfR, LRPs, LDLR i IR (Haqqani, Delaney, et al., 2013).

Z opisanych badań powinno być oczywiste, że ramię nośnikowe BBB bsAb ukierunkowanych na CNS wymaga starannej optymalizacji dla każdego receptora RMT. Poniżej omówiono ważne kwestie związane z projektowaniem bsAb ukierunkowanych na CNS w świetle „lessons-learned” z rozwoju bsAb TfR-BACE1 oraz z naszej własnej pracy z FC5 jako przeciwciałem przenoszącym BBB.

.

Leave a Reply

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.