Chemia medyczna

Wprowadzenie

Chemia medyczna jest dyscypliną, która obejmuje projektowanie, rozwój i syntezę leków farmaceutycznych. Dyscyplina ta łączy wiedzę z chemii, zwłaszcza syntetycznej chemii organicznej, farmakologii i innych nauk biologicznych. Jest to również część chemii medycznej oceny właściwości istniejących leków.

Użycie roślin, minerałów i części zwierząt jako leki zostały zapisane od najbardziej starożytnych cywilizacji. Wraz z rozwojem wiedzy, środki do odkrywania leków również ewoluowały. Nowe cząsteczki o potencjalnym znaczeniu farmaceutycznym, „trafienia”, są produktami naturalnymi lub związkami wygenerowanymi przez chemię obliczeniową, lub związkami z przesiewowych bibliotek chemicznych, z chemii kombinatorycznej i z biotechnologii farmaceutycznej. Związek „trafiony” jest ulepszany pod względem właściwości farmakologicznych, farmakodynamicznych i farmakokinetycznych poprzez modyfikacje chemiczne lub modyfikacje grup funkcyjnych, co przekształca go w związek wiodący. Związek wiodący powinien mieć znaną strukturę i znany mechanizm działania. Związek wiodący jest dalej optymalizowany, aby stać się kandydatem na lek, który jest bezpieczny do zastosowania w badaniach klinicznych u ludzi (Rysunek 1) .

Medicinal Chemistry Figure 1

Rysunek 1. Ramy czasowe odkrywania leków.

Odkrywanie leków
Produkty naturalne

Produkty naturalne były głównym źródłem związków wiodących w odkrywaniu nowych leków w leczeniu chorób zakaźnych, zaburzeń lipidowych, chorób neurologicznych, chorób sercowo-naczyniowych i metabolicznych, chorób immunologicznych, zapalnych i pokrewnych oraz chorób onkologicznych (Tabela 1) . Spośród jednostek farmaceutycznych zatwierdzonych na świecie w latach 1981-2006 5,7% stanowiły produkty naturalne, a 27,6% cząsteczki pochodne produktów naturalnych, natomiast w latach 2005-2010 siedem produktów naturalnych i 12 pochodnych produktów naturalnych zostało zatwierdzonych do stosowania w praktyce klinicznej. Medycyna tradycyjna może jednak również produkować fałszywe tropy, jak to zostało ostatnio zweryfikowane w przypadku kurkuminy .

.

.

Obszar choroby Nazwa rodzajowa (nazwa handlowa) Związek wiodący Rok
Przeciwbakteryjne Doripenem (Finibax/Doribax®) Thienamycyna 2005
Przeciwpasożytnicze Fumagilina (Flisint®) Fumagilina 2005
Onkologiczne Romidepsin (Istodax®) Romidepsin 2009
choroba Alzheimera Galantamina (Reminyl®) Galantamina 2002
Immunosupresja Mikofenolan sodu (Myfortic®) Kwas mykofenolowy 2003
Dyslipidemia Rosuwastatyna (Crestor®)
Cukrzyca Eksenatyd (Byetta®) Eksenatyd 2006
Tabela 1. Przykłady produktów naturalnych i pochodnych produktów naturalnych będących obecnie w użyciu klinicznym.
Wybór organizmu

Związki naturalne charakteryzują się dużą różnorodnością chemiczną. Pochodzą one z różnych organizmów. Wybór roślin, mikroorganizmów, grzybów lub innych organizmów do badań w poszukiwaniu nowych związków opiera się na przypadkowych badaniach przesiewowych, wyborze określonych grup taksonomicznych, chemotaksonomicznej grupy metabolitów wtórnych, takich jak alkaloidy, przeglądzie bazy danych kolekcji gatunków lub podejściu etnomedycznym. Kilka leków wywodzi się z zastosowań etnobotanicznych.

Zbieranie próbek

0,3 do 1 Kg suszonej rośliny lub 1 Kg mokrej masy próbek morskich powinno być zebrane z różnych części organizmu. Jeśli próbka musi być ponownie zebrana, należy to zrobić w tym samym miejscu i o tej samej porze dnia, ponieważ w różnych siedliskach mogą występować różne metabolity wtórne. Ważne jest również zdeponowanie reprezentatywnego vouchera w centralnym repozytorium, w celu późniejszego dostępu. Poza roślinami, w ostatniej dekadzie zainteresowanie grzybami, sinicami pochodzenia morskiego i ewolucja technik „eksploracji genomu” do hodowli mikroorganizmów w laboratorium doprowadziły do odkrycia nowych produktów naturalnych.

Ekstrakcja

Protokoły ekstrakcji różnią się w zależności od laboratorium. Początkowa ekstrakcja roślin zwykle odbywa się za pomocą polarnego rozpuszczalnika, takiego jak metanol lub etanol. Następnie poddaje się ją procesowi odtłuszczania poprzez podział rozpuszczalnikiem niepolarnym, takim jak heksan lub eter naftowy. Ekstrakt jest rozdzielany między półbiegunowym rozpuszczalnikiem, takim jak chloroform lub dichlorometan, a polarnym rozpuszczalnikiem wodnym. Organizmy morskie i wodne są ekstrahowane w stanie świeżym metanolem lub dichlorometanem. Z ekstraktów należy usunąć garbniki roślinne. Ich obecność może prowadzić do wytrącania się białek i hamowania enzymów, zakłócając wyniki testów biologicznych.

Puryfikacja i izolacja

Oddzielanie związków czynnych odbywa się za pomocą kilku technik chromatograficznych. Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC) i jej sprzężenie z testami typu high-throughput screening (HST) upraszczają oczyszczanie i izolację związków aktywnych. Związki są identyfikowane za pomocą magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i spektrometrii mas (MS). Techniki te, w połączeniu z chromatografią cieczową (LC), pozwalają na jednoczesne oczyszczanie i określanie struktury związków biologicznie czynnych. Oczyszczanie i izolacja związków aktywnych są mierzone przez testy biologiczne. Badania HTS mogą oceniać dużą liczbę ekstraktów lub związków w kontekście komórkowym lub niekomórkowym.

W uzupełnieniu do HPLC, nowa metoda łącząca szybką chromatografię przeciwprądową (HSCCC) i chromatografię wykluczenia rozmiaru z Sephadex LH-20 została skutecznie zastosowana do ekstrakcji związków neuroprotekcyjnych z morskiej brązowej algi, Ecklonia maxima . Struktura wyizolowanych związków została zweryfikowana przez NMR i MS.

Głównym wyzwaniem w rozwoju związków naturalnych jest uzyskanie znaczących ilości do dalszego rozwoju. Ponowne zbieranie gatunków, z których pochodzą, lub hodowla tkanek roślinnych, lub hodowla i fermentacja na dużą skalę dla mikrobów pochodzenia lądowego mogą produkować związki na dużą skalę. Związki naturalne mogą być również syntetyzowane. Na przykład, Kawano S et al osiągnęli całkowitą syntezę jednego z halichondryn, grupy strukturalnie złożonych produktów naturalnych wyizolowanych z różnych gąbek morskich, i zajęli się problemem ograniczonej podaży materiałów .

Chemia obliczeniowa

Modelowanie molekularne, lub bardziej ogólnie, chemia obliczeniowa, stało się dobrze ugruntowaną częścią rozwoju leków. Modelowanie molekularne wyszukuje nowe molekuły, w oparciu o platformę teoretyczną lub poprzez badanie biblioteki. Informacje krystalograficzne i/lub NMR o receptorach i specyficznych celach, takich jak regulator przewodnictwa transmembranowego mukowiscydozy (CFTR), pozwalają poprzez techniki modelowania molekularnego zaprojektować nowe cząsteczki dla danego celu. Inne podejścia wykorzystują znane aktywne molekuły jako cel i projektują nowe molekuły lub przeszukują biblioteki w poszukiwaniu podobnych molekuł (rysunek 2).

Modelowanie interakcji białko-białko (PPI) staje się cennym narzędziem do rozwoju nowych strategii terapeutycznych ukierunkowanych na selektywne modyfikatory PPI. Na przykład, nowa metoda łączy spektrometrię mas z modelowaniem w celu wygenerowania przeciwciał hamujących wzajemne oddziaływanie pomiędzy R7BP, regulatorem odczuwania świądu, a RGS7/Gβ5. Aktywność inhibicyjną oceniano za pomocą spektroskopii rezonansu plazmonów powierzchniowych.

Medicinal Chemistry Figure 2

Figure 2. Computational chemistry approaches for the development of new drugs.

Znalezione „trafione” cząsteczki mogą być zsyntetyzowane w laboratorium lub zakupione. Po ocenie i ujawnieniu zależności struktura-aktywność-relacja (SAR), można przeprowadzić nowe badania modelowania molekularnego w celu znalezienia bardziej aktywnej cząsteczki lub optymalizacji znalezionej cząsteczki (Rysunek 2).

Chemia obliczeniowa opiera się na wizualizacji i manipulacji trójwymiarowymi modelami molekularnymi. Rotacja wiązań, budowanie struktur, mechanizmy molekularne i/lub dynamika, analiza konformacyjna, właściwości elektroniczne, wyświetlanie powierzchni molekularnych i obliczanie różnych właściwości fizycznych są możliwe dzięki modelowaniu molekularnemu. Stosowane techniki to symulacje mechanizmów molekularnych i dynamiki molekularnej, techniki Monte Carlo, dokowanie ligandów i wirtualne metody przesiewowe.

Obecny stan techniki pozwala na pracę z ponad 20 cząsteczkami i tysiącami punktów powierzchni molekularnej w czasie rzeczywistym. Każda cząsteczka może być oznaczona kolorem i kontrolowana w trzech wymiarach, gdzie odległości wewnątrzcząsteczkowe i nieciągłe kąty dwuścienne mogą być regulowane i monitorowane. Kształt, ładunek i hydrofobowość atomów w cząsteczce mogą być również symulowane. Gradient potencjału elektrostatycznego lub pole elektryczne mogą być również wyświetlane graficznie za pomocą krótkich wektorów. Modelowanie molekularne wymaga make-bond, break-bond, fuse rings, delete-atom, add-atom, add-hydrogens, invert chiral center, itp. Te operacje powinny pozwolić na uzyskanie wyrafinowanej struktury dla wybranego celu.

Do projektowania nowych związków o określonych funkcjach zaimplementowano metodę fragment-based reinforcement learning. Metoda ta, deep fragment-based multi-parameter optimization, wykorzystuje sieci o długiej pamięci krótkotrwałej do tworzenia nowych cząsteczek o wymaganych właściwościach ze związków wiodących poprzez modyfikację ich części. Model aktora-krytyka, podstawa tego podejścia, implementuje uczenie różnic czasowych.

Opracowano wiele systemów do przechowywania i wyszukiwania informacji generowanych przez modelowanie molekularne. Liczba nowych cząsteczek wygenerowanych przez modelowanie molekularne może liczyć tysiące dla jednego celu, co sprawia, że synteza i ocena biologiczna wszystkich tych nowych cząsteczek jest wyzwaniem. Rozwój wirtualnych badań przesiewowych pozwolił na przezwyciężenie tego problemu. Po wirtualnej ocenie przesiewowej tylko cząsteczki o wymaganej aktywności biologicznej byłyby syntetyzowane lub kupowane do dalszej oceny biologicznej.

Click chemistry

Click chemistry jest nową metodą syntezy związków o właściwościach zbliżonych do leków, która może zwiększyć potencjał odkrywania leków poprzez wykorzystanie praktycznych i prostych reakcji. Na przykład, biomimetyczne hydrożele zostały zsyntetyzowane dla hydrożelowego żelowania opartego na enkapsulacji komórek. Synteza została przeprowadzona poprzez połączenie kwasu hialuronowego i siarczanu chondroityny z diakrylanem glikolu polietylenowego i modyfikację stopni tiolowych glikozaminoglikanów. Enkapsulacja wykazała wysoką żywotność komórek i była skuteczna w badaniu odpowiedzi komórkowych 3D.

Także, techniki chemii kliknięć w połączeniu z przesiewaniem opartym na cytometrii przepływowej zostały zastosowane do generowania aptamerów. Podejście to wykazuje kilka zalet, takich jak zdolność do wykonywania różnych modyfikacji chemicznych i do przesiewania dużej liczby aptamerów. W szczególności, wygenerowano aptamery o wysokim powinowactwie do epinefryny i konkawaliny A.

Chemiczne bazy danych

Niemal codziennie syntetyzuje się i ocenia biologicznie wiele związków chemicznych. W ostatnich latach około 2000-3000 związków zostało opublikowanych w głównych czasopismach z dziedziny chemii medycznej.

PubChem, CheMBL i BindingBD są publicznymi bazami danych o związkach i ich bioaktywności. Dostępne są również inne bazy danych, takie jak ChemBank i IUPHARDB (Tabela 2). Drug Repurposing Hub i ZINC15 są wykorzystywane do wirtualnych badań przesiewowych, na przykład w poszukiwaniu nowych antybiotyków.

Narodowy Instytut Zdrowia (NIH) założył w 2004 roku bazę PubChem, publiczną bibliotekę zawierającą ponad 33 miliony związków chemicznych. Głównym celem tej bazy danych jest gromadzenie i rozpowszechnianie informacji na temat aktywności biologicznej małych cząsteczek. Zaczęło się od gromadzenia testów biologicznych wykonywanych w NIH, obecnie akceptuje dane z innych źródeł, takich jak depozyty. PubChem nie zawiera informacji pozyskiwanych z literatury, jednak dołączenie danych z CheMBL i BindingBD pozwala na dostęp do kilku zestawów kuratorskich danych literaturowych . Według stanu na wrzesień 2019 r. baza danych zawiera 96 324 655 związków, 235 712 478 substancji, 1 067 644 testów biologicznych, 268 177 463 bioaktywności, 17 847 celów białkowych i 58 029 celów genowych.

Nazwa bazy danych Liczba związków Strona internetowa
PubChem 96 milionów http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
CheMBL 1.87 mln https://www.ebi.ac.uk/chembl/
BindingBD 0.76 mln http://www.bindingdb.org/bind/index.jsp
ChemSpider 76 mln http://www.chemspider.com/
DrugBank 13,370 http://www.drugbank.ca/
SwissADME http://www.swissadme.ch/
Tabela 2. Wybrane przykłady chemicznych baz danych, stan na wrzesień, 2019.

CheMBL została zainicjowana zestawem produktów komercyjnych, stała się publiczna w styczniu 2010 roku. Biblioteka ta przechwytuje dane z literatury z zakresu chemii medycznej. W zakresie tej bazy danych znajdują się powinowactwa białko-ligand oraz dane dotyczące komórek. Od niedawna ChEMBL zawiera dane dotyczące białek terapeutycznych i innych typów leków, a także dane dotyczące małych cząsteczek. Wydanie ChEMBL24_1 zawiera 1,879,206 związków, 1,125,387 testów, 12,481 celów i 72271 dokumentów, stan na wrzesień, 2019.

BindingBD wywodzi się ze środowiska akademickiego, z końca lat 90-tych. Ta baza danych początkowo koncentrowała się na małych cząsteczkach o zgłoszonej aktywności biologicznej. BindingBD koncentruje się na warunkach badania i czynnikach zgłoszonych jako wpływające na wynik badania, takich jak pH, temperatura i substraty. Wirtualne badania przesiewowe można przeprowadzić bezpośrednio za pomocą narzędzi witryny internetowej BindingBD . Na wrzesień 2019, BindingDB zawiera 1,714,438 danych wiążących, dla 7,336 celów białkowych i 761,317małych cząsteczek.

Wraz z rosnącą liczbą związków publikowanych każdego roku, znaczenie bibliotek chemicznych z wolnym dostępem w odkrywaniu leków jest krytyczne.

Chemia kombinatoryczna

Chemia kombinatoryczna jest definiowana jako laboratoryjna synteza lub wspomagane obliczeniowo projektowanie dużej liczby cząsteczek, zaczynając od jednego rusztowania. Rusztowanie powinno mieć zróżnicowane punkty do modyfikacji, poprzez połączenie ze znanymi cząsteczkami lub cząsteczkami pochodzącymi z badania modelowania molekularnego. Chemia kombinatoryczna została wykorzystana do optymalizacji związku wiodącego .

Jednym z najlepszych podejść w chemii kombinatorycznej jest użycie centralnego rusztowania z kilkoma podstawnikami, które mogą być niezależnie modyfikowane. Takie podejście zwiększa możliwość znalezienia „trafionej” cząsteczki, ponieważ zsyntetyzowane cząsteczki mają większą różnorodność molekularną.

Synteza równoległa, metoda chemii kombinatorycznej, pozwala na utworzenie dużego zestawu związków. Utworzona mieszanina może być badana pod kątem aktywności biologicznej. Jeśli mieszanina nie wykazuje aktywności, można ją zarchiwizować i później badać pod kątem innych aktywności biologicznych. Gdy okaże się, że mieszanina jest aktywna, wyzwaniem staje się wyizolowanie aktywnego związku. Jedną z wad zsyntetyzowanych cząsteczek w chemii kombinatoryjnej jest słaba różnorodność, w porównaniu do związków naturalnych.

Większość syntezy kombinatorycznej przeprowadzana jest za pomocą technik fazy stałej. Materiał wyjściowy jest związany, bezpośrednio lub poprzez linker, z kulką. Reagenty są dodawane i powstaje produkt. Procedura ta może być powtarzana wielokrotnie z wykorzystaniem wcześniej utworzonego produktu jako materiału wyjściowego (Rysunek 3). Produkt może być usunięty z kulki lub bezpośrednio badany z dołączoną kulką, pod kątem aktywności biologicznej. Koraliki ograniczają reakcje uboczne i powstawanie produktów ubocznych. Łączniki powinny być odporne na warunki reakcji i łatwe do usunięcia po syntezie.

Medicinal Chemistry Rysunek 3

Rysunek 3. Uproszczony schemat chemii kombinatorycznej.

Proste techniki chemii kombinatorycznej pozwalają na syntezę jednego produktu w jednym naczyniu. Bardziej złożone metody, takie jak mieszana synteza kombinatoryczna, pozwalają na syntezę złożonych mieszanin. Ręczne techniki syntezy jednego związku na naczynie, takie jak procedura torebki herbaty Houghtona, są nadal stosowane. Zautomatyzowana synteza równoległa jest obecnie najczęściej stosowaną metodą.

W syntezie dużych ilości różnorodnych związków często wykorzystuje się technikę mix and split. W metodzie tej pierwszą zsyntetyzowaną mieszaninę związków dzieli się na n części, n części ponownie poddaje się nowej modyfikacji, syntetyzując z nowych mieszanin (z = n × liczba różnych modyfikacji). Procedura ta może być powtarzana aż do osiągnięcia pożądanej liczby modyfikacji. Mieszaniny mogą być badane przed dokonaniem nowej modyfikacji. W ten sposób wykluczy się mieszaniny, w których nie obserwuje się aktywności biologicznej, unikając dalszej modyfikacji.

Gdy mieszanina jest biologicznie aktywna, można zastosować techniki mikromanipulacji, dekonwolucji rekursywnej i sekwencyjnego uwalniania w celu oddzielenia związku(ów) aktywnego(ych). Identyfikacja i elucyfikacja strukturalna są przeprowadzane po wyizolowaniu aktywnego(ych) związku(ów).

Ocena bibliotek wygenerowanych przez chemię kombinatoryczną jest zwykle dokonywana przez HTS . Opracowywane są metody przesiewowe wykorzystujące fluorescencję i chemoluminescencję; które pozwalają na jednoczesną identyfikację związków aktywnych.

Chemia kombinatoryczna przynosi również wyraźne korzyści w badaniach nad nanomateriałami. W szczególności pomaga ona w prowadzeniu syntez kontrolowanych chiralnością. Niedawno opracowana metoda pozwala na łączenie prekursorów nanorurek węglowych o każdej możliwej chiralności w jednym kroku. Po wygenerowaniu prekursorów następuje utrwalenie na powierzchni metalu, cyklodwodorowanie i wydłużenie nanorurek węglowych o ustalonej chiralności.

Biotechnologia farmaceutyczna

Biotechnologia farmaceutyczna jest najnowszą dziedziną chemii medycznej, zajmującą się wytwarzaniem nowych produktów terapeutycznych i diagnostycznych. Powszechnie stosowanymi produktami są peptydy i białka, hormony różnego pochodzenia oraz enzymy, w tym szczepionki i przeciwciała monoklonalne (tab. 3). Odkrywanie nowych leków w biotechnologii farmaceutycznej odbywa się poprzez genomikę, transkryptomikę, proteomikę, farmakogenomikę i metabolikę.

Obszar choroby Nazwa ogólna (Nazwa handlowa) Typ bioproduktu
Typ II Peptydy
Osteoporoza Teriparatyd (Forteo®) Hormony
Choroba typu I Cukrzyca Glukagon (GlucaGen®) Hormon
Choroba zapalenia wątroby typu C Interferon zgodny (IFN Alfacon-
Polio Polio (Ipol®) Szczepionka
Measles Rubella (Meruvax®) Szczepionka
Lupus Belimumab (Benlysta®) Przeciwciało monoklonalne
Astma Omalizumab (Xolair®) Przeciwciało monoklonalne
Tabela 3. Niektóre przykłady biotechnologicznych produktów farmaceutycznych będących obecnie w użyciu klinicznym.

Optymalizacja związku wiodącego

Optymalizacja związku wiodącego może być dokonana po znalezieniu „trafionego” związku poprzez ocenę biologiczną. Optymalizacja ma na celu poprawę wchłaniania, dystrybucji, metabolizmu i wydalania leku (właściwości ADME), zmniejszenie toksyczności i poprawę skuteczności.

Związek wiodący może być modyfikowany poprzez jego grupy funkcyjne w celu uzyskania lepszej absorpcji, uniknięcia degradacji enzymatycznej oraz poprawy profilu wydalania. Poprawa wchłaniania może być dokonana poprzez syntezę pro-leku. W celu uniknięcia degradacji enzymatycznej grupa docelowa może być zmodyfikowana tak, aby blokować działanie kluczowego enzymu metabolicznego. Profil wydalania można poprawić poprzez chemiczną modyfikację związku wiodącego w celu zmniejszenia wiązania np. z albuminami. Synteza organiczna może również poprawić właściwości farmakologiczne cząsteczki wiodącej, poprzez zwiększenie bioaktywności i zmniejszenie efektów ubocznych.

Związek wiodący może być modyfikowany przez połączenie z serią cząsteczek z bibliotek chemicznych lub z modelowania molekularnego. Można to osiągnąć za pomocą wcześniej opisanych technik chemii kombinatorycznej. Procedura ta jest szczególnie przydatna w przypadku leadów z różnymi grupami funkcyjnymi, które mogą być niezależnie modyfikowane poprzez techniki mix and split. Modyfikacje wykonywane za pomocą chemii kombinatorycznej mogą poprawić właściwości ADME oraz zwiększyć specyficzność i skuteczność cząsteczki wiodącej.

Komputerowa modulacja wiodącej cząsteczki może zwiększyć specyficzność, gdy dostępny jest strukturalny obraz 3D celu, dopasowując cząsteczkę do celu. Zastosowanie chemii obliczeniowej do produkcji prawie idealnych dopasowań do celu zmniejsza również prawdopodobieństwo wystąpienia działań niepożądanych i toksyczności. Chemia obliczeniowa jest również przydatna do tworzenia i badań przesiewowych praktycznie wiodących związków o lepszych właściwościach absorpcyjnych i mniejszej degradacji metabolicznej.

Związki naturalne mogą być przedmiotem optymalizacji ołowiu, z modyfikacjami chemicznymi, optymalizacją formuły i poprawą farmakokinetyki. Istotne jest odniesienie, że niektóre ważne wnioski SAR mogą być osiągnięte poprzez obserwację aktywności biologicznej związków wyizolowanych równolegle ze związkiem wiodącym.

Związki wybrane z modelowania molekularnego i badań przesiewowych bibliotek chemicznych i kombinatorycznych mogą być poddane optymalizacji opisanymi technikami. Ma to na celu poprawę właściwości farmakokinetycznych i farmakologicznych związków. W tej fazie można również wyznaczyć SAR pomiędzy różnymi związkami.

Badania wokół potencjalnego kandydata na lek mogą zawsze powrócić do rozwoju wiodącej cząsteczki w dowolnym punkcie badań wstępnych i klinicznych. Interakcja różnych dziedzin, takich jak chemia, biologia, biochemia, farmakologia i medycyna, przyczynia się do udanego projektowania leków.

Deklaracje

Dr Konstantin Yakimchuk zaktualizował artykuł i dodał sekcje dotyczące chemii kliknięć we wrześniu 2019 roku.

Leave a Reply

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.