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Símbolo del gen: RNASA1

1. Generalidades

La ribonucleasa pancreática también conocida como ribonucleasa A (RNasa A) o ribonucleasa 1 (RNasa1) es una enzima que cataliza la descomposición del ARN y desempeña un papel en la digestión del ARN en las especies vertebradas. Los primeros trabajos se centraron en la RNasa pancreática bovina debido a la gran cantidad presente en el páncreas. Se ha descrito como la enzima mejor estudiada del siglo XX, con cuatro premios Nobel concedidos por estudios sobre esta proteína (20). Debido a los altos niveles presentes en el páncreas bovino, la RNasa1 fue considerada históricamente como una enzima digestiva, pero con poco propósito en los seres humanos y otros mamíferos no rumiantes (2) donde existe en concentraciones mucho más bajas. Sin embargo, la digestión del ARN se produce en el intestino de todas las especies y ahora se sabe que la RNasa1 y otros miembros de su superfamilia tienen funciones adicionales en la defensa del huésped que se discutirán más adelante.

Estructura y mecanismo de acción

La RNasa1 bovina fue purificada y cristalizada por Kunitz en 1939 (16) y secuenciada por Smyth, Stein y Moore en 1963 (30). Contiene 124 aminoácidos, un peso molecular calculado de 13.683 y un exceso de residuos básicos que conducen a un punto isoeléctrico de 8,5 – 9,0. Contiene cuatro enlaces disulfuro y se ha utilizado como modelo para estudiar el plegamiento de las proteínas (22). También está glicosilada en los residuos de asparagina y la forma glicosilada se denominó originalmente RNasa B. Debido a la glicosilación y a la estructura terciaria, aparece en la mayoría de los geles SDS con 18 o 19 kDa. La RNasa 1 porcina contiene 125 aminoácidos (26); la RNasa 1 humana contiene 3 aminoácidos más en el terminal carboxilo que la RNasa1 bovina (4). La RNasa1 bovina fue la primera enzima cuya estructura tridimensional se determinó. Tiene una forma general como la de una judía con el sitio activo en la hendidura que contiene His12, His119 y Lys41 (25). Otros sitios de unión no catalíticos ayudan a la enzima a formar un complejo con su sustrato polimérico. La RNasa1 cataliza la hidrólisis de los enlaces 3′,5′-fosfodiéster en el ARN monocatenario cuando la base del lado 3′ es una pirimidina (7, 11, 23). El proceso se suele representar como si ocurriera en dos etapas, con el primer paso que implica la formación de un fosfodiéster cíclico y el segundo su hidrólisis (23). La RNasa 1 no hidroliza el ADN ya que carece de un grupo 2′-OH. Esto permite utilizarla para eliminar la contaminación de ARN del ADN. También se utiliza en los ensayos de protección contra ribonucleasas. La RNasa 1 forma dímeros mediante el intercambio de dominios de los aminoterminales por la formación de enlaces sulfhidrilos de manera que cada sitio activo se mantenga activo (18). Aunque conservan la función hidrolítica, los dímeros adquieren una actividad biológica adicional con dímeros, trímeros y tetrámeros que poseen actividad antitumoral

Superfamilia de la ribonucleasa A

El genoma humano codifica 122 ribonucleasas distintas. La superfamilia de la ARNasa A consta de ocho ribonucleasas «canónicas» con actividad enzimática y homología estructural con la RNasa A (15). Todas son proteínas secretoras que comparten una estructura terciaria con enlaces disulfuro y son capaces de degradar el ARN. Todas están codificadas en una estrecha región del cromosoma 14 tanto en humanos como en ratones (27) y se cree que se originaron a partir de la duplicación de genes (3, 31). Aunque el gen contiene varios exones, la región codificante es aportada por un solo exón. El conocimiento de su función fisiológica es incompleto, pero la mayoría son importantes para la defensa del huésped y la angiogénesis, así como para la digestión (9). El primer miembro descrito es la RNasa 1 que, además de ser una enzima pancreática, se produce en una variedad de células, incluidas las células endoteliales vasculares, donde tras su secreción degrada el ARN polimérico vascular y tiene actividad contra el VIH-1 (15). Las RNasas 2 y 3 son proteínas secretoras de los eosinófilos denominadas neurotoxina derivada de los eosinófilos (EDN) y proteína catiónica de los eosinófilos (ECP) respectivamente (15). La RNasa 4 está presente en múltiples tejidos, pero su función fisiológica no está clara. La RNasa 5, también conocida como angiogenina, induce el crecimiento de los vasos sanguíneos (10). La RNasa 7 es la más abundante en la piel, mientras que la RNasa 8 se expresa en la placenta (15). Otros genes del grupo están relacionados con las ribonucleasas (RNasa 9 a 13), pero sus proteínas tienen mutaciones que impiden la actividad de la RNasa. Algunas de las RNasas secretadas o sus oligómeros pueden entrar en las células y ejercer efectos citotóxicos, especialmente en las células tumorales.

Inhibidor de la ribonucleasa

El inhibidor de la ribonucleasa de los mamíferos (RI) es una proteína citosólica de 50 KDa que se une con alta afinidad y estequiometría 1:1 a la ribonucleasa pancreática, inactivándola (8, 17). Es particularmente abundante en la placenta y el hígado y se ha utilizado para purificar la RNasa. Inhibe todos los miembros de la familia de la RNasa A. Su estructura tridimensional es la de una herradura que contiene repeticiones ricas en leucina. Aunque su función biológica no está clara, debería unirse e inactivar a cualquier miembro de la familia RNasa A que se escape de la vía secretoria y entre en el citoplasma.

2. Función de la ribonucleasa en el páncreas

La mayoría de las células contienen concentraciones milimolares de ribonucleótidos pero sólo concentraciones micromolares de desoxirribonucleótidos (5). Por tanto, la dieta contiene una mezcla de ribonucleoproteínas, ARN y ribonucleótidos. Las nucleoproteínas son descompuestas por la proteasa pancreática. La opinión de los libros de texto es que los ácidos nucleicos de la dieta son descompuestos por la RNasa y la DNasa pancreáticas en el intestino. Sin embargo, un estudio reciente ha demostrado que la pepsina del estómago también hidroliza el ácido nucleico, por lo que esta digestión comienza allí (19). Entre los alimentos ricos en ribonucleoproteínas se encuentran las vísceras, el marisco y las legumbres (5).

La RNasa pancreática (RNasa 1) está presente en todos los páncreas de los vertebrados, pero su cantidad varía mucho (2). Entre los mamíferos con grandes cantidades se encuentran los ungulados, los roedores y los marsupiales herbívoros. En la vaca, la RNasa constituye el 20% de la enzima digestiva; se cree que este requisito se debe a la gran carga de ARN que producen las bacterias de la fermentación ruminal. En otras especies, como el ser humano, el perro, el gato y los vertebrados inferiores, la RNasa está presente en cantidades mucho menores y puede representar sólo del 0,5 al 1% de las enzimas pancreáticas. Aunque sólo existen unos pocos estudios, la RNasa pancreática en todas las especies parece descomponer el ácido nucleico de la dieta en el lumen del intestino en nucleótidos, que a su vez son descompuestos por la fosfatasa alcalina intestinal y la 5’nucleotidasa en nucleósidos y bases nitrogenadas libres. Por lo tanto, la digestión de los ácidos nucleicos tiene una fase luminal y otra de borde en cepillo. Estos productos son absorbidos por los enterocitos, pero la mayoría se excretan en la orina; algunos se utilizan para la resíntesis principalmente en el estado de ayuno (13, 21, 29). Normalmente se absorben entre el 80 y el 90% de los nucleótidos, que pueden llegar a ser esenciales en ciertas enfermedades o en períodos de ingesta limitada o de crecimiento rápido (5).

La ribonucleasa se sintetiza en las células acinares por el RE rugoso, se pliega y se empaqueta en gránulos de zimógeno a partir de los 20 días de gestación en la rata (33). El plegado se produce mucho más rápidamente en las células en comparación con la proteína aislada y, salvo una pequeña cantidad de dímero, cualquier proteína que no termine como monómero plegado se degrada (12). Es secretada al medio de forma paralela a otras enzimas digestivas por los lóbulos y acinos pancreáticos estimulados con CCK o análogos colinérgicos (14, 24, 28). La síntesis de RNasa 1 se reduce en la diabetes experimental en un 50% pero mucho menos que la disminución de la amilasa.

3. Herramientas para el estudio de la Ribonucleasa1

a. Anticuerpos

Biocompare (www.biocompare.com) recoge 394 anticuerpos contra ribonucleasas de 32 proveedores. Algunos son específicos de la especie, mientras que otros son específicos para la RNasa1 u otros miembros de la familia. No hemos probado ninguno de estos anticuerpos.

b. Actividad de ribonucleasas

Los primeros ensayos de ribonucleasas utilizaban la hidrólisis de ARN de levadura; nosotros utilizamos un ensayo descrito por Anfinsen (1) para medir la secreción de ribonucleasas pancreáticas por acinos pancreáticos de rata aislados (24). Sin embargo, estos ensayos no son específicos para la RNasa1 y funcionaron para el estudio de la secreción acinar pancreática porque la RNasa1 es la principal forma presente en los acinos pancreáticos. También se ha descrito un ensayo que utiliza la hidrólisis de la citidina 2′-3′-fosfato (6). Recientemente se ha desarrollado un ensayo cuantitativo de fluorescencia basado en la unión del bromuro de etidio al ARN de levadura (32).

4. Referencias

  1. Anfinsen CB, Redfield RR, Choate WL, Page J, y Carroll WR. Estudios sobre la estructura bruta, enlaces cruzados y secuencias terminales en la ribonucleasa. J Biol Chem 207: 201-210, 1954. PMID: 13152095
  2. Barnard EA. Función biológica de ribonucleasa pancreática. La naturaleza 221: 340-344, 1969. PMID: 4974403
  3. Beintema JJ, y Kleineidam RG. La ribonuclea A superfamilia: discusión general. Cell Mol Life Sci 54: 825-832, 1998. PMID: 9760991
  4. Beintema JJ, Wietzes P, Weickmann JL, y Glitz DG. La secuencia de aminoácidos de la ribonucleasa pancreática humana. Anal Biochem 136: 48-64, 1984. PMID: 6201087
  5. Carver JD, y Walker, WA. El papel de los nucleótidos en la nutrición humana. J Nutr Biochem 6: 58 – 72, 1995.
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  9. Dyer KD, y Rosenberg HF. La superfamilia RNasa a: generación de diversidad y defensa innata del huésped. Mol Divers 10: 585-597, 2006. PMID: 16969722
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