Pancreapedia

Gene Symbool: RNASE1

1. Algemeen

Pancreatisch ribonuclease ook bekend als ribonuclease A (RNase A) of ribonuclease 1 (RNase1) is een enzym dat de afbraak van RNA katalyseert en een rol speelt bij de vertering van RNA bij gewervelde diersoorten. Vroeg werk was gericht op boviene pancreas RNase vanwege de grote hoeveelheid die aanwezig is in de pancreas. Het is beschreven als het best bestudeerde enzym van de 20e eeuw met vier Nobelprijzen toegekend voor studies over dit eiwit (20). Vanwege de hoge concentraties in de alvleesklier van runderen werd RNase1 van oudsher beschouwd als een spijsverteringsenzym, maar met weinig nut bij de mens en andere niet-herkauwende zoogdieren (2), waar het in veel lagere concentraties voorkomt. De vertering van RNA vindt echter plaats in de darm van alle diersoorten en van RNase1 en andere leden van zijn superfamilie is nu bekend dat zij aanvullende functies hebben in de verdediging van de gastheer, die later zullen worden besproken.

Structuur en werkingsmechanisme

Rovine RNase1 werd gezuiverd en gekristalliseerd door Kunitz in 1939 (16) en gesequeneerd door Smyth, Stein en Moore in 1963 (30). Het bevat 124 aminozuren, een berekend moleculair gewicht van 13.683 en een overmaat aan basische residuen die leiden tot een iso-elektrisch punt van 8,5 – 9,0. Het bevat vier disulfidebindingen en is gebruikt als model om eiwitvouwing te bestuderen (22). Het is ook geglycosyleerd op asparaginaresiduen, waarbij de geglycosyleerde vorm oorspronkelijk RNase B werd genoemd. Vanwege de glycosylering en de tertiaire structuur loopt het op de meeste SDS-gels op tot 18 of 19 kDa. Varkens RNase 1 bevat 125 aminozuren (26); menselijk RNase 1 bevat 3 extra aminozuren aan de carboxyl-terminal dan runder RNase1 (4). Rund RNase1 was het eerste enzym waarvan de driedimensionale structuur is bepaald. Het heeft een algemene vorm als een nierboon met de actieve plaats in de kloof die His12, His119 en Lys41 bevat (25). Andere niet-katalytische bindingsplaatsen helpen het enzym een complex te vormen met zijn polymere substraat. RNase1 katalyseert de hydrolyse van 3′,5′-fosfodiesterbindingen in enkelstrengs RNA wanneer de base aan de 3′-zijde een pyrimidine is (7, 11, 23). Het proces wordt gewoonlijk voorgesteld als een proces dat in twee fasen verloopt, waarbij in de eerste fase een cyclische fosfodiëster wordt gevormd en in de tweede fase de hydrolyse plaatsvindt (23). RNase 1 hydrolyseert geen DNA omdat het geen 2′-OH groep heeft. Daardoor kan het worden gebruikt om RNA-verontreiniging uit DNA te verwijderen. Het wordt ook gebruikt in ribonuclease protectietests. RNase 1 vormt dimeren door verwisseling van domeinen van amino termini door sulfhydrylbindingsvorming op zodanige wijze dat elke actieve site actief blijft (18). Met behoud van de hydrolytische functie verkrijgen de dimeren een extra biologische activiteit met dimeren, trimeren en tetrameren die anti-tumoractiviteit bezitten

Ribonuclease A superfamilie

Het menselijk genoom codeert voor 122 afzonderlijke ribonucleasen. De RNAse A superfamilie bestaat uit acht “canonieke” ribonucleasen met enzymatische activiteit en structurele homologie met RNase A (15). Het zijn allemaal secretorische proteïnen die een disulfidegebonden tertiaire structuur delen en in staat zijn RNA af te breken. Alle eiwitten worden gecodeerd in een nauwe regio van chromosoom 14 bij zowel mensen als muizen (27) en men denkt dat ze zijn ontstaan door gen duplicatie (3, 31). Hoewel het gen verscheidene exonen bevat, wordt de coderende regio bijgedragen door een enkel exon. Het inzicht in hun fysiologische rol is onvolledig, maar de meeste zijn belangrijk voor de verdediging van de gastheer en de angiogenese, alsmede voor de vertering (9). Het eerste beschreven lid is RNase 1, dat niet alleen een pancreasenzym is, maar ook wordt geproduceerd in een verscheidenheid van cellen, waaronder vasculaire endotheelcellen, waar het na secretie vasculair polymeer-RNA afbreekt en anti-HIV-1 activiteit heeft (15). RNase 2 en 3 zijn uitscheidingseiwitten van eosinofielen die respectievelijk eosinophil derived neurotoxin (EDN) en eosinophil cationic protein (ECP) worden genoemd (15). RNase 4 is aanwezig in meerdere weefsels, maar zijn fysiologische rol is onduidelijk. RNase 5, ook bekend als angiogenine, induceert de groei van bloedvaten (10). RNase 7 is het RNase dat het meest voorkomt in de huid, terwijl RNase 8 tot expressie komt in de placenta (15). Andere genen in de cluster zijn verwant met ribonucleasen (RNase 9 tot 13), maar hun eiwitten hebben mutaties die de RNase-activiteit verhinderen. Sommige van de gesecreteerde RNasen of hun oligomeren kunnen cellen binnendringen en cytotoxische effecten uitoefenen, vooral op tumorcellen.

Ribonuclease inhibitor

Mammalia ribonuclease inhibitor (RI) is een cytosolisch eiwit van 50 KDa dat zich met een hoge affiniteit en 1:1 stoichiometrie bindt aan pancreas ribonuclease, waardoor het wordt geïnactiveerd (8, 17). Het is bijzonder overvloedig aanwezig in placenta en lever en is gebruikt om RNase te zuiveren. Het remt alle leden van de RNase A-familie. De driedimensionale structuur is die van een hoefijzer dat leucinerijke herhalingen bevat. Hoewel de biologische rol niet duidelijk is, zou het elk lid van de RNase A-familie dat aan de secretorische route ontsnapt en in het cytoplasma terechtkomt, moeten binden en inactiveren.

2. Rol van ribonuclease in de pancreas

De meeste cellen bevatten millimolaire concentraties ribonucleotiden, maar slechts micromolaire concentraties desoxyribonucleotiden (5). De voeding bevat dus een mengsel van ribonucleoproteïnen, RNA en ribonucleotiden. Nucleoproteïnen worden afgebroken door pancreasprotease. De gangbare opvatting is dat nucleïnezuren in de voeding worden afgebroken door pancreas RNase en DNase in de darm. Een recente studie heeft echter aangetoond dat pepsine in de maag ook nucleïnezuur hydrolyseert, zodat deze vertering daar begint (19). Voedingsmiddelen rijk aan ribonucleoproteïnen zijn onder meer orgaanvlees, zeevruchten en peulvruchten (5).

Pancreas RNase (RNase 1) is aanwezig in alle gewervelde pancreas, maar de hoeveelheid varieert sterk (2). Zoogdieren met grote hoeveelheden zijn onder meer hoefdieren, knaagdieren en herbivore buideldieren. Bij de koe maakt RNase 20% uit van het spijsverteringsenzym; men denkt dat deze behoefte te wijten is aan de grote hoeveelheid RNA die wordt geproduceerd door bacteriën bij pensfermentatie. Bij andere diersoorten, waaronder de mens, hond, kat en lagere gewervelde dieren, is RNase in veel kleinere hoeveelheden aanwezig en maakt het wellicht slechts 0,5 tot 1% van de pancreasenzymen uit. Hoewel er slechts weinig studies bestaan, lijkt pancreas RNase bij alle diersoorten nucleïnezuur uit de voeding in de darmlumen af te breken tot nucleotiden, die verder worden afgebroken door intestinale alkalische fosfatase en 5’nucleotidase tot nucleosiden en vrije stikstofhoudende basen. De vertering van nucleïnezuren kent derhalve een luminale en een borstelgrensfase. Deze producten worden geabsorbeerd door enterocyten, maar de meeste worden uitgescheiden in de urine; sommige worden gebruikt voor resynthese, voornamelijk in de nuchtere toestand (13, 21, 29). Normaal worden 80 tot 90% van de nucleotiden geabsorbeerd en deze kunnen essentieel worden in bepaalde ziekten of perioden van beperkte opname of snelle groei (5).

Ribonuclease wordt gesynthetiseerd in acinarcellen door ruw ER, gevouwen en verpakt in zymogene korrels vanaf 20 dagen dracht bij de rat (33). Het vouwen gebeurt veel sneller in de cellen in vergelijking met het geïsoleerde eiwit en met uitzondering van een kleine hoeveelheid dimeer wordt elk eiwit dat niet als een gevouwen monomeer eindigt, afgebroken (12). Het wordt parallel met andere spijsverteringsenzymen in het medium uitgescheiden door pancreaslobben en -acini die met CCK of cholinerge analogen worden gestimuleerd (14, 24, 28). De synthese van RNase 1 is verminderd bij experimentele diabetes met 50%, maar veel minder dan de vermindering voor amylase.

3. Hulpmiddelen voor de studie van Ribonuclease1

a. Antilichamen

Biocompare (www.biocompare.com) geeft een lijst van 394 ribonuclease-antilichamen van 32 leveranciers. Sommige zijn soortspecifiek, terwijl andere specifiek zijn voor RNase1 of andere familieleden. Wij hebben geen van deze antilichamen getest.

b. Ribonuclease-activiteit

Eerdere ribonuclease-assays gebruikten de hydrolyse van gist-RNA; wij gebruikten een assay beschreven door Anfinsen (1) om de secretie van pancreasribonuclease door geïsoleerde rattenpancreaseacini te meten (24). Deze assays zijn echter niet specifiek voor RNase1 en werkten voor de studie van pancreatische acinar secretie omdat RNase1 de belangrijkste vorm is die in pancreatische acini aanwezig is. Er is ook een assay beschreven waarbij gebruik wordt gemaakt van de hydrolyse van cytidine 2′-3′-fosfaat (6). Onlangs werd een kwantitatieve fluorescentietest ontwikkeld op basis van de binding van ethidiumbromide aan gist-RNA (32).

4. Referenties

  1. Anfinsen CB, Redfield RR, Choate WL, Page J, and Carroll WR. Studies on the gross structure, cross-linkages, and terminal sequences in ribonuclease. J Biol Chem 207: 201-210, 1954. PMID: 13152095
  2. Barnard EA. Biological function of pancreatic ribonuclease. Natuur 221: 340-344, 1969. PMID: 4974403
  3. Beintema JJ, and Kleineidam RG. The ribonuclease A superfamily: general discussion. Cell Mol Life Sci 54: 825-832, 1998. PMID: 9760991
  4. Beintema JJ, Wietzes P, Weickmann JL, and Glitz DG. The amino acid sequence of human pancreatic ribonuclease. Anal Biochem 136: 48-64, 1984. PMID: 6201087
  5. Carver JD, and Walker, WA. De rol van nucleotiden in de menselijke voeding. J Nutr Biochem 6: 58 – 72, 1995.
  6. Crook EM, Mathias AP, and Rabin BR. Spectrophotometric assay of bovine pancreatic ribonuclease by the use of cytidine 2′:3′-phosphate. Biochem J 74: 234-238, 1960. PMID: 13812977
  7. Cuchillo CM, Nogues MV, and Raines RT. Bovine pancreatic ribonuclease: fifty years of the first enzymatic reaction mechanism. Biochemie 50: 7835-7841, 2011. PMID: 21838247
  8. Dickson KA, Haigis MC, and Raines RT. Ribonuclease inhibitor: structure and function. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 80: 349-374, 2005. PMID: 16164979
  9. Dyer KD, and Rosenberg HF. The RNase a superfamily: generation of diversity and innate host defense. Mol Divers 10: 585-597, 2006. PMID: 16969722
  10. Fett JW, Strydom DJ, Lobb RR, Alderman EM, Bethune JL, Riordan JF, and Vallee BL. Isolation and characterization of angiogenin, an angiogenic protein from human carcinoma cells. Biochemie 24: 5480-5486, 1985. PMID: 4074709
  11. Findlay D, Herries DG, Mathias AP, Rabin BR, and Ross CA. The active site and mechanism of action of bovine pancreatic ribonuclease. Nature 190: 781-784, 1961. PMID: 13699542
  12. Geiger R, Gautschi M, Thor F, Hayer A, and Helenius A. Folding, quality control, and secretion of pancreatic ribonuclease in live cells. J Biol Chem 286: 5813-5822, 2011. PMID: 21156800
  13. Ho CY, Miller KV, Savaiano DA, Crane RT, Ericson KA, and Clifford AJ. Absorptie en metabolisme van oraal toegediende purines bij gevoede en nuchtere ratten. J Nutr 109: 1377-1382, 1979. PMID: 458492
  14. Iwanij V, and Jamieson JD. Biochemical analysis of secretory proteins synthesized by normal rat pancreas and by pancreatic acinar tumor cells. J Cell Biol 95: 734-741, 1982. PMID: 6185502
  15. Koczera P, Martin L, Marx G, and Schuerholz T. The Ribonuclease A Superfamily in Humans: Canonical RNases as the Buttress of Innate Immunity. Int J Mol Sci 17: 2016. PMID: 27527162
  16. Kunitz M. Crystalline Ribonuclease. J Gen Physiol 24: 15-32, 1940. PMID: 19873197
  17. Lee FS, and Vallee BL. Structure and action of mammalian ribonuclease (angiogenin) inhibitor. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 44: 1-30, 1993. PMID: 8434120
  18. Libonati M. Biological actions of the oligomers of ribonuclease A. Cell Mol Life Sci 61: 2431-2436, 2004. PMID: 15526151
  19. Liu Y, Zhang Y, Dong P, An R, Xue C, Ge Y, Wei L, and Liang X. Digestion of Nucleic Acids Starts in the Stomach. Sci Rep 5: 11936, 2015. PMID: 26168909
  20. Marshall GR, Feng JA, and Kuster DJ. Terug naar de toekomst: ribonuclease A. Biopolymers 90: 259-277, 2008. PMID: 17868092
  21. McAllan AB. The degradation of nucleic acids in, and the removal of breakdown products from the small intestines of steers. Br J Nutr 44: 99-112, 1980. PMID: 6158999
  22. Moore S, and Stein WH. Chemische structuren van pancreas ribonuclease en deoxyribonuclease. Science 180: 458-464, 1973. PMID: 4573392
  23. Nogues MV, Vilanova M, and Cuchillo CM. Bovine pancreatic ribonuclease A as a model of an enzyme with multiple substrate binding sites. Biochim Biophys Acta 1253: 16-24, 1995. PMID: 7492594
  24. Otsuki M, and Williams JA. In dit project wordt nagegaan in hoeverre de rol van de menselijke factor in het ontstaan van de ziekte kan worden ingeschat. J Clin Invest 70: 148-156, 1982. PMID: 6177717
  25. Raines RT. Ribonuclease A. Chem Rev 98: 1045-1066, 1998.
  26. Reinhold VN, Dunne FT, Wriston JC, Schwarz M, Sarda L, and Hirs CH. The isolation of porcine ribonuclease, a glycoprotein, from pancreatic juice. J Biol Chem 243: 6482-6494, 1968. PMID: 5715511
  27. Samuelson LC, Wiebauer K, Howard G, Schmid RM, Koeplin D, and Meisler MH. Isolation of the murine ribonuclease gene Rib-1: structure and tissue specific expression in pancreas and parotid gland. Nucleic Acids Res 19: 6935-6941, 1991. PMID: 1840677
  28. Scheele GA, and Palade GE. Studies over de pancreas van de cavia. Parallel discharge of exocrine enzyme activities. J Biol Chem 250: 2660-2670, 1975. PMID: 1123325
  29. Schwenk M, Hegazy E, and Lopez del Pino V. Uridine uptake by isolated intestinal epithelial cells of guinea pig. Biochim Biophys Acta 805: 370-374, 1984. PMID: 6210111
  30. Smyth DG, Stein WH, and Moore S. The sequence of amino acid residues in bovine pancreatic ribonuclease: revisions and confirmations. J Biol Chem 238: 227-234, 1963. PMID: 13989651
  31. Sorrentino S. The eight human “canonical” ribonucleases: molecular diversity, catalytic properties, and special biological actions of the enzyme proteins. FEBS Lett 584: 2194-2200, 2010. PMID: 20388512
  32. Tripathy DR, Dinda AK, and Dasgupta S. A simple assay for the ribonuclease activity of ribonucleases in the presence of ethidium bromide. Anal Biochem 437: 126-129, 2013. PMID: 23499964
  33. Van Nest GA, MacDonald RJ, Raman RK, and Rutter WJ. Proteins synthesized and secreted during rat pancreatic development. J Cell Biol 86: 784-794, 1980. PMID: 7410479

Leave a Reply

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.