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4.3 BBB-crossing bsAbs engineered with single-domain antibodies

sdAbs are small (15 kDa), monomeric antigen-binding fragments of antibodies which provide various advantages over other antibody fragments as «building blocks» for bsAbs. Se encuentran en la naturaleza como la porción de unión al antígeno de los anticuerpos de cadena pesada en especies de camélidos (llamados VHH) y peces cartilaginosos (llamados VNAR) o pueden generarse a partir de IgGs convencionales mediante la obtención o ingeniería de dominios VH o VL monoméricos y estables (Hamers-Casterman et al., 1993; Hussack et al., 2012; Kim et al., 2014; Nuttall, 2012; Ward, Güssow, Griffiths, Jones, & Winter, 1989). Los sdAbs son muy estables y compactos y pueden acceder a epítopos empotrados en las proteínas, como las cavidades de los receptores o los sitios activos de las enzimas, que a menudo están «ocultos» para las IgG convencionales y pueden alcanzar afinidades de unión a la diana comparables a las de los anticuerpos convencionales (Lauwereys et al., 1998; Staus et al., 2014). Estas unidades monoméricas de unión a antígenos no se emparejan con las cadenas ligeras, lo que las convierte en excelentes bloques de construcción para bsAbs heterodimerizados, ya que evitan las dificultades del emparejamiento inadecuado de las cadenas ligeras (Hamers-Casterman et al., 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). Los bsAbs heterodiméricos pueden crearse con uno o ambos «brazos» siendo sdAb, siendo estos últimos similares en estructura a los anticuerpos de cadena pesada de los camélidos (Fig. 3E). Los sdAbs también pueden utilizarse en varias fusiones mono-, bi- o tetravalentes con anticuerpos terapéuticos convencionales o Fabs (Fig. 3E), dando lugar generalmente a moléculas más pequeñas y menos complejas, en comparación con las generadas con scFvs o Fabs como bloques de construcción, que tienden a tener un buen comportamiento biofísico y son fáciles de producir (Holliger & Hudson, 2005). La humanización de los VHHs así como la ingeniería de los sdAbs está bien descrita, permitiendo generar fácilmente sdAbs humanos(izados) con una afinidad óptima por la diana y propiedades biofísicas excepcionales (Vincke et al., 2009).

Para evaluar el uso potencial del VHH FC5 de camélidos como portador de la BBB dentro de anticuerpos biespecíficos dirigidos al SNC, se diseñaron y evaluaron in vitro e in vivo fusiones monovalentes y bivalentes (N- y C-terminal) de FC5 con Fc humano (Farrington et al., 2014). La afinidad de unión aparente (Kdapp) a la BEC de rata de la fusión FC5Fc bivalente fue de 75 nM, mientras que la unión del FC5Fc monovalente estuvo en el rango micromolar. Los análisis de las tasas de transmigración aparente (Papp) a través de un modelo de BBB in vitro, la exposición aparente en el SNC derivada de la farmacocinética del suero y el líquido cefalorraquídeo de las construcciones de anticuerpos administradas sistémicamente, y las respuestas farmacológicas provocadas por péptidos neuroactivos químicamente conjugados e impermeables a la BBB en el modelo de dolor de Hargreaves, proporcionaron pruebas de un mayor transporte en la BBB de estas moléculas de anticuerpos de gran tamaño (75 kDa) mediado por el FC5: (1) los valores de Papp in vitro fueron de ~ 200 cm/min para las moléculas de fusión Fc mono y bivalente N-terminal (FC5Fc) en comparación con los 4-8 cm/min de los VHH A20 de control.1Fc o EG2Fc; (2) la exposición aparente al SNC de la fusión FC5Fc fue 30 veces mayor en comparación con las fusiones anticuerpo-Fc de dominio de control; (3) la potencia farmacológica sistémica de los conjugados FC5Fc con los neuropéptidos dalargin o galanina en el modelo de dolor inflamatorio de Hargreaves fue hasta 60 veces mayor en comparación con los conjugados monoméricos FC5-neuropéptido. Este resultado se atribuyó a la larga vida media circulatoria (~ 96 h) del FC5Fc- en comparación con los conjugados FC5-neuropéptidos; (4) varios conjugados de neuropéptidos VHH-Fc de control no mostraron eficacia sistémica; (5) la fusión del FC5 con el extremo C del Fc dio lugar a una capacidad atenuada de atravesar la BBB. En contraste con los anticuerpos portadores de la BBB dirigidos a TfR, tanto las proteínas de fusión FC5Fc mono como bivalentes mostraron una tasa similar de transcitosis in vitro, perfiles farmacocinéticos similares en plasma/CSF y una potencia sistémica similar en el modelo farmacodinámico in vivo, a pesar de las diferencias en la afinidad y valencia de unión aparente (Farrington et al., 2014). Estos estudios demostraron que el anticuerpo de un solo dominio que atraviesa la BBB, el FC5, puede utilizarse como portador de la BBB de plataforma tanto en «medios anticuerpos» heterodimerizados como en la fusión bi o tetravalente más fácilmente escalable a las IgG convencionales (Farrington et al., 2014).

Otra ventaja potencial de los VHHs como portadores de la BBB es su resistencia natural a los desafíos biofísicos extremos, como la temperatura y el pH, así como a la degradación de las proteasas (Kim et al., 2014), que a menudo se encuentran en varios compartimentos endocíticos durante la transcitosis. Tanto las fusiones FC5 como FC5Fc se internalizan en BEC a través de vesículas recubiertas de clatrina, y se clasifican en endosomas tempranos. Curiosamente, también se descubrió que el FC5 estimula el desprendimiento de microvesículas extracelulares (exosomas) de las BEC (Haqqani, Caram-Salas, et al., 2013; Haqqani, Delaney, et al., 2013) en las que se detectaron tanto el FC5 como el aumento de los niveles de su receptor putativo Cdc50A mediante Western blot y espectrometría de masas dirigida. Este estudio sugirió que los exosomas desechados pueden ser la vesícula final de la vía RMT liberada de la superficie abluminal que lleva el complejo receptor-anticuerpo (mostrado esquemáticamente en la Fig. 4). La vía RMT y la formación de exosomas comparten algunas similitudes notables. Como se indicó en el primer descubrimiento de los exosomas, un anticuerpo anti-TfR fue rastreado por microscopía electrónica en los reticulocitos (Théry, 2011) desde la superficie de las células, dentro de las fosas recubiertas de clatrina, en el interior de los endosomas tempranos, en la superficie de las vesículas internas de los endosomas multivesiculares y, finalmente, en los exosomas liberados tras la fusión de los endosomas multivesiculares con la membrana plasmática (Fig. 4). La RMT parece desarrollarse de forma similar y se ha demostrado que las microvesículas extracelulares de las BEC contienen varios receptores conocidos por transportar macromoléculas a través de la BBB a través de la RMT, incluyendo el TfR, los LRP, el LDLR y el IR (Haqqani, Delaney, et al., 2013).

A partir de los estudios descritos, debería ser evidente que el brazo portador de la BBB de los bsAb dirigidos al SNC requiere una cuidadosa optimización para cada receptor de la RMT. A continuación se discuten consideraciones importantes en el diseño de bsAbs dirigidos al SNC en vista de las «lecciones aprendidas» del desarrollo del bsAb TfR-BACE1 y de nuestro propio trabajo con el FC5 como anticuerpo portador de la BBB.

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