Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy

筋肉および筋肉以外の疾患に対する新しい治療法、筋芽細胞による遺伝子治療では培養した筋芽細胞を成熟骨格筋へ移植することが基本となっています。 筋芽細胞移植による筋欠陥の矯正の成功は、移植した細胞が宿主の筋繊維と融合するかどうかにかかっている。 マウスを用いたこれまでの研究では、確立された筋原細胞株や初代筋培養物の移植が行われてきたため、問題があった。 筋原性細胞株は腫瘍化しやすく、初代培養物にはかなりの割合で非筋原性細胞が含まれ、宿主線維と融合しない。 さらに、どちらの細胞集団も、移植された細胞を長期間維持するためには、宿主の免疫抑制が必要であった。 これらの困難を克服するために、我々は初代培養からマウスの筋芽細胞を精製することができる新しい培養条件を開発した。 初代筋芽細胞の濃縮集団とクローン集団の両方を、細胞増殖と分化のアッセイで特性評価した。 初代筋芽細胞は増殖のために添加したbFGFに依存し、30回の集団倍加後でも分化能を保持していた。 移植後の純粋な筋芽細胞集団の運命は、レトロウイルスを介した遺伝子導入により、マーカー酵素であるβ-ガラクトシダーゼ(β-gal)で細胞を標識することでモニターされた。 成熟マウスの筋肉への移植後5日以内に、初代筋芽細胞は宿主の筋肉細胞と融合し、ハイブリッド筋繊維を形成した。 一次筋芽細胞の免疫生物学を調べるために、同種および同系統の宿主に移植した細胞を比較検討した。 免疫抑制を行わなくても、ハイブリッド線維は、同種宿主の筋芽細胞移植後6ヶ月までβ-galの発現が持続した。 同系統の宿主では、移植された細胞は3週間以内に完全に除去された。 腫瘍形成性を評価するために、初代筋芽細胞およびC2筋原細胞株からの筋芽細胞を免疫不全マウスに移植した。 腫瘍を形成したのはC2筋芽細胞のみであった。 このようにマウス初代筋芽細胞の単離、増殖、トランスフェクションが容易であることから、正常マウスだけでなく変異マウス系統の筋芽細胞を用いて筋細胞の増殖・分化を研究する機会が広がっている。 移植後のこれらの細胞の特性、すなわち免疫抑制を伴わないハイブリッド筋繊維の安定性、導入遺伝子の発現の持続性、腫瘍形成性の欠如は、初代筋芽細胞を用いた細胞仲介遺伝子治療の研究が、ヒト筋肉および非筋肉疾患のモデルマウスに広く適用できることを示唆するものである。

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