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Gene Symbol: rnase1

1. General

リボヌクレアーゼA(RNase A)またはリボヌクレアーゼ1(RNase1)とも呼ばれる膵臓リボヌクレアーゼは、RNAの分解を触媒する酵素で、脊椎動物のRNAの消化に関与している。 初期の研究では、膵臓に多量に存在することから、ウシ膵臓RNaseに焦点が当てられた。 このタンパク質の研究に対して4つのノーベル賞が授与され、20世紀で最もよく研究された酵素と言われている(20)。 ウシの膵臓に大量に存在することから、RNase1は歴史的に消化酵素として考えられてきたが、ヒトや他の非反芻動物(2)では、はるかに低い濃度で存在するため、あまり意味がない。 しかし、RNAの消化はすべての種の腸内で行われ、RNase1やそのスーパーファミリーの他のメンバーには、後述する宿主防御のための付加的な機能があることが知られるようになった。 アミノ酸数124、分子量13,683、塩基性残基過剰のため等電点8.5-9.0である。 4つのジスルフィド結合を持ち、タンパク質のフォールディングを研究するモデルとして用いられている(22)。 また、アスパラギン残基でグリコシル化されており、グリコシル化型はもともとRNase Bと呼ばれていた。グリコシル化と三次構造のために、ほとんどのSDSゲルでは18kDaか19kDaで検出される。 豚のRNase 1は125個のアミノ酸を含んでいる(26)。ヒトのRNase 1は牛のRNase 1よりもカルボキシル末端に3個のアミノ酸を追加している(4)。 ウシRNase1は、その立体構造が決定された最初の酵素である。 全体的にインゲンマメのような形をしており、His12、His119、Lys41を含むクレフトが活性部位である(25)。 他の非触媒的結合部位は、酵素が高分子基質と複合体を形成するのを助ける。 RNase1は、3’側の塩基がピリミジンである場合、一本鎖RNAの3’,5′-ホスホジエステル結合の加水分解を触媒する(7, 11, 23)。 このプロセスは通常2段階で行われ、第1段階では環状ホスホジエステルが形成され、第2段階ではそれが加水分解されると表現される(23)。 RNase 1は2′-OH基を持たないため、DNAを加水分解することはない。 このため、DNAに混入したRNAを除去するのに使用できる。 また、リボヌクレアーゼ保護アッセイにも使用される。 RNase 1は、スルフヒドリル結合形成によるアミノ末端のドメインスワップにより、各活性部位を活性に保つように二量体を形成する(18)。 この二量体は加水分解機能を保持したまま、二量体、三量体、四量体として抗腫瘍活性を持つなど、さらなる生物活性を獲得する

Ribonuclease A Superfamily

ヒトゲノムには122種の異なるリボヌクレアーゼがコードされている。 RNAse Aスーパーファミリーは、RNase Aに構造的な相同性を持ち、酵素活性を持つ8つの「カノニカル」リボヌクレアーゼから構成されている(15)。 いずれも分泌タンパク質であり、ジスルフィド結合を持つ三次構造を持ち、RNAを分解することができる。 いずれもヒトとマウスの14番染色体の狭い領域にコードされており(27)、遺伝子重複から生まれたと考えられている(3, 31)。 この遺伝子には複数のエキソンが存在するが、コーディング領域は1つのエキソンによって寄与されている。 その生理的役割の理解は不完全であるが、多くは消化だけでなく、宿主防御や血管新生にも重要である(9)。 RNase 1は、膵臓の酵素であることに加え、血管内皮細胞を含む様々な細胞で生産され、分泌後、血管の高分子RNAを分解し、抗HIV-1活性を持つ(15)。 RNase 2と3は、それぞれ好酸球由来神経毒(EDN)、好酸球カチオン性タンパク質(ECP)と呼ばれる好酸球分泌タンパク質です(15)。 RNase 4 は、複数の組織に存在するが、その生理的な役割は不明である。 RNase 5は、angiogeninとしても知られ、血管の成長を誘導する(10)。 RNase 7は皮膚に最も多く存在するRNaseであり、RNase 8は胎盤に発現している(15)。 このクラスターにはさらにリボヌクレアーゼに関連する遺伝子(RNase 9〜13)があるが、それらのタンパク質はRNase活性を阻害する変異を有している。 分泌されたRNaseやそのオリゴマーは細胞内に侵入し、特に腫瘍細胞に対して細胞毒性を示すものがある。

リボヌクレアーゼインヒビター

哺乳類のリボヌクレアーゼインヒビター(RI)は50KDaの細胞質タンパク質で、膵臓リボヌクレアーゼと1:1の化学量論で親和的に結合してこれを不活性にする (8, 17)。 胎盤や肝臓に特に多く存在し、RNaseの精製に利用されている。 RNase A ファミリーの全メンバーを阻害する。 その立体構造は、ロイシンリッチリピートを含む馬蹄形である。 膵臓におけるリボヌクレアーゼの役割

ほとんどの細胞には、ミリモル濃度のリボヌクレオチドがあるが、マイクロモル濃度のデオキシリボヌクレオチドしかない(5)。 したがって、食事にはリボヌクレオタンパク質、RNA、リボヌクレオチドの混合物が含まれている。 核タンパクは膵臓のプロテアーゼによって分解される。 教科書的には、食物の核酸は腸内で膵臓のRNaseとDNaseによって分解されると考えられている。 しかし、最近の研究では、胃のペプシンも核酸を加水分解するので、この消化はそこから始まることが分かっている(19)。 リボ核タンパクを多く含む食品としては、内臓肉、魚介類、豆類などがある(5)。

膵臓RNase(RNase1)は、すべての脊椎動物の膵臓に存在するが、その量は大きく異なる(2)。 大量に存在する哺乳類には、有蹄類、齧歯類、草食性の有袋類がある。 牛の場合、RNaseは消化酵素の20%を占める。この必要性は、ルーミン発酵によりバクテリアによって大量のRNAが生成されるためと考えられている。 ヒト、イヌ、ネコおよび下等脊椎動物を含む他の種では、RNase の存在量ははるかに少なく、膵臓酵素の 0.5 から 1%を占めるに過ぎないと考えられる。 わずかな研究しか存在しないが、すべての種の膵臓RNaseは、腸管内腔で食物核酸をヌクレオチドに分解し、さらに腸のアルカリホスファターゼと5’ヌクレオチダーゼによってヌクレオシドと遊離窒素塩基に分解されるようである。 従って、核酸の消化には内腔相と刷子縁相がある。 これらの生成物は腸管細胞によって吸収されるが、大部分は尿中に排泄される。一部は主に絶食状態で再合成に使われる(13, 21, 29)。 通常、ヌクレオチドの80〜90%が吸収されるが、ある種の病気や摂取量の制限、急成長期にはこれらが必須となることがある(5)。

リボヌクレアーゼはアシナー細胞で粗面小胞体により合成され、ラットでは妊娠20日から折りたたまれてジモゲン顆粒にパッケージングされる(33)。 細胞内での折りたたみは単離タンパク質に比べて非常に速く、折りたたまれた単量体として終わらないタンパク質は少量の二量体を除いて分解される(12)。 CCKやコリン作動性アナログで刺激された膵臓の小葉や腺房から、他の消化酵素と並行して培地に分泌される (14, 24, 28)。 実験的糖尿病ではRNase1の合成は50%減少するが、アミラーゼの減少よりはるかに少ない

3. Ribonuclease1の研究手段

a. Antibodies

Biocompare (www.biocompare.com) は、32のサプライヤーから394のリボヌクレアーゼ抗体をリストアップしている。 種特異的なものもあれば、RNase1や他のファミリーメンバーに特異的なものもある。 我々はこれらの抗体のいずれもテストしていない。

b. リボヌクレアーゼ活性<7248><3612>初期のリボヌクレアーゼアッセイは、酵母RNAの加水分解を用いた;我々は、Anfinsen(1)により記述されたアッセイを用いて、単離ラット膵尖による膵リボヌクレアーゼの分泌を測定した(24)。 しかし、これらのアッセイはRNase1に特異的ではなく、RNase1が膵臓棘に存在する主要な形態であるため、膵臓棘分泌の研究に有効であった。 また、シチジン2′-3′-リン酸の加水分解を利用したアッセイも報告されている(6)。 最近、酵母のRNAにエチジウムブロマイドを結合させた定量蛍光法が開発された(32)。 参考文献

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