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4.3 BBB-交差型bsAbs engineered with single-domain antibodies

sdAbs は小さな(15kDa)モノマー抗原結合抗体フラグメントで、他の抗体フラグメントに比べてbsAbsの「ビルディングブロック」として様々な利点を持っています。 それらは、ラクダ科動物(VHHと呼ばれる)及び軟骨魚類(VNARと呼ばれる)の重鎖抗体の抗原結合部分として自然界に存在するか、又は単量体の安定なVH又はVLドメインを得るか又は工学的に設計することによって従来のIgGから生成できる(Hamas-Castermanら、1993;Hussackら、2012;Kimら、.All.Abs)。 2014; Nuttall, 2012; Ward, Güssow, Griffiths, Jones, & Winter, 1989)。 sdAbsは非常に安定でコンパクトであり、従来のIgGからはしばしば「隠される」受容体キャビティまたは酵素の活性部位などのタンパク質中の凹型エピトープにアクセスでき、従来の抗体と同等の標的結合親和性を達成できる(Lauwereysら、1998;Stausら、2014)。 これらの単量体抗原結合ユニットは、軽鎖とペアリングしないため、不適切な軽鎖のペアリングの困難を回避できるため、ヘテロ二量化bsAbsの優れたビルディングブロックとなる(Hamas-Casterman et al, 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008)。 ヘテロ二量体bsAbsは、一方または両方の「アーム」がsdAbであるものを作成することができ、後者はラクダの重鎖抗体に構造が似ている(図3E)。sdAbsはまた、従来の治療抗体またはFabsとの種々の1、2または4価の融合で用いることができる(図3D)。 3E)、一般に、scFvまたはFabsをビルディングブロックとして生成された分子と比較して、より小さく、より複雑でない分子が得られ、これらは生物物理的に良好な挙動を示し、容易に製造できる傾向がある(Holliger & Hudson、2005)。 sdAbsのエンジニアリングと同様にVHHのヒト化はよく説明されており、最適な標的親和性と並外れた生物物理学的特性を有するヒト(化)sdAbsを容易に生成することができる(Vincke et al,

二重特異性CNS標的抗体内のBBBキャリアとしてのラクダ科VHH FC5の使用の可能性を評価するために、FC5の一価および二価融合(N末およびC末)とヒトFcを設計し、in vitroおよびin vivoで評価した(ファリントンら、2014年)。 二価FC5Fc融合体のラットBECに対する見かけの結合親和性(Kdapp)は75nMであったが、一価FC5Fcの結合はマイクロモル領域であった。 また,in vitro BBBモデルでの透過率(Papp),全身投与した抗体分子の血清/CSF薬物動態から得られるCNSへの曝露量,Hargreaves疼痛モデルで化学結合したBBB不透過性神経活性ペプチドによって引き起こされる薬理反応などの解析から,これらの大きな(75 kDa)抗体分子がFC5によってBBB輸送を促進されていることが明らかとなった. (1) in vitroのPapp値は、一価および二価のN末端Fc融合分子(FC5Fc)ともに、コントロールのVHH A20の4-8cm/minに対して、〜200cm/minであった。1FcまたはEG2Fc融合体、(2)FC5Fc融合体の見かけのCNS曝露量は、コントロールのドメイン抗体-Fc融合体に比べて30倍高かった、(3)FC5Fcと神経ペプチドdalarginまたはgalaninの結合体の全身薬理効力は、単量体のFC5-神経ペプチド結合体と比べて最大60倍高かった、Hargreaves炎症性疼痛モデルで、このことは、この融合体は、FC5-NFc結合体が、CNSに曝露されたことを意味する。 この結果は、FC5-神経ペプチド結合体よりもFC5Fc-結合体の方が循環半減期が長い(〜96時間)ことに起因する。(4)種々のコントロールVHH-FC神経ペプチド結合体は全身に有効でない。(5)FC5をFcのC末端に融合するとBBB通過能が減弱する。 TfR標的BBBキャリア抗体とは対照的に、一価および二価のFC5Fc融合タンパク質は、見かけの結合親和性および価数には差があるものの、in vitroでは同様のトランスサイトーシス速度、同様の血漿/CSF薬物動態プロファイル、およびin vivoの薬力学モデルにおいて同様の全身的効力を示した(Farrington et al.、2014年)。 これらの研究は、BBB横断単一ドメイン抗体FC5が、ヘテロ二量化「ハーフ抗体」および従来のIgGに対するより容易に拡張可能な2価または4価の融合の両方において、プラットフォームBBBキャリアとして使用できることを示した(Farrington et al,

BBBキャリアとしてのVHHのもう1つの潜在的な利点は、温度およびpHなどの極端な生物物理的課題、ならびにトランスサイトーシス中に様々なエンドサイトコンパートメントでしばしば遭遇するプロテアーゼ分解(Kimら、2014)へのその自然な耐性である。 FC5およびFC5Fc融合体はいずれもクラスリン被覆小胞を介してBECに内在化され、初期エンドソームに選別される。 興味深いことに、FC5はBECからの細胞外マイクロベシクル(エクソソーム)の排出を刺激することも見出され(Haqqani, Caram-Salas, et al.2013; Haqqani, Delaney, et al.2013 )、FC5とその推定受容体のCdc50Aレベルの増加がウェスタンブロットと標的質量分析で検出された。 この研究により、排出されたエクソソームは、受容体-抗体複合体を運ぶアブルミナル表面から放出されるRMT経路の最終小胞である可能性が示唆された(図4に模式的に示す)。 RMT経路とエクソソーム形成には、いくつかの顕著な共通点がある。 エクソソームの最初の発見で概説したように、網状赤血球において、抗TfR抗体が、細胞表面からクラスリン被覆ピット内、初期エンドソーム内、多胞性エンドソームの内部小胞表面、最終的には多胞性エンドソームと細胞膜が融合した後に放出されたエクソソーム上まで電子顕微鏡で追跡した(Théry、2011)(Fig. 4)。 RMTは同様の方法で展開するようであり、BEC細胞外小胞は、TfR、LRP、LDLR、IRなど、RMTを介してBBBを越えて高分子を運ぶことが知られているいくつかの受容体を含むことが示されている(Haqqani, Delaney, et al, 2013)<6585><1267>記載した研究から、CNS標的bsAbのBBBキャリアアームは各RMT受容体に慎重に最適化が求められることが明らかになるはずだ。 TfR-BACE1 bsAbの開発から得られた「教訓」と、BBBキャリア抗体としてのFC5を用いた私たち自身の研究から、CNS標的bsAbを設計する際の重要な考慮事項について、以下に説明します

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