Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy

Il trapianto di mioblasti coltivati nel muscolo scheletrico maturo è la base per un nuovo approccio terapeutico alle malattie muscolari e non muscolari: la terapia genica mediata da mioblasti. Il successo del trapianto di mioblasti per la correzione di difetti muscolari intrinseci dipende dalla fusione delle cellule impiantate con le miofibre dell’ospite. Gli studi precedenti nei topi sono stati problematici perché hanno coinvolto il trapianto di linee cellulari miogeniche stabilite o di colture muscolari primarie. Entrambe queste popolazioni di cellule hanno degli svantaggi: le linee cellulari miogeniche sono tumorali e le colture primarie contengono una percentuale sostanziale di cellule non miogeniche che non si fondono con le fibre dell’ospite. Inoltre, per entrambe le popolazioni di cellule, la soppressione immunitaria dell’ospite è stata necessaria per il mantenimento a lungo termine delle cellule trapiantate. Per superare queste difficoltà, abbiamo sviluppato nuove condizioni di coltura che permettono la purificazione dei mioblasti di topo da colture primarie. Sia le popolazioni arricchite che quelle clonali di mioblasti primari sono state caratterizzate in saggi di proliferazione e differenziazione cellulare. I mioblasti primari erano dipendenti dal bFGF aggiunto per la crescita e mantenevano la capacità di differenziarsi anche dopo 30 raddoppi di popolazione. Il destino delle popolazioni di mioblasti puri dopo il trapianto è stato monitorato etichettando le cellule con l’enzima marcatore beta-galattosidasi (beta-gal) utilizzando il trasferimento genico mediato da retrovirus. Entro cinque giorni dal trapianto nel muscolo di topi maturi, i mioblasti primari si erano fusi con le cellule muscolari ospiti per formare miofibre ibride. Per esaminare l’immunobiologia dei mioblasti primari, abbiamo confrontato le cellule trapiantate in ospiti singeni e allogenici. Anche senza soppressione immunitaria, le fibre ibride persistevano con un’espressione beta-gal continua fino a sei mesi dopo il trapianto di mioblasti negli ospiti singenici. Negli ospiti allogenici, le cellule impiantate sono state completamente eliminate entro tre settimane. Per valutare la tumorigenicità, i mioblasti primari e i mioblasti della linea cellulare miogenica C2 sono stati trapiantati in topi immunodeficienti. Solo i mioblasti C2 hanno formato tumori. La facilità di isolamento, crescita e trasfezione dei mioblasti primari di topo nelle condizioni qui descritte espande le opportunità di studiare la crescita e la differenziazione delle cellule muscolari usando mioblasti da ceppi di topi normali e mutanti. Le proprietà di queste cellule dopo il trapianto – la stabilità delle miofibre ibride risultanti senza soppressione immunitaria, la persistenza dell’espressione del transgene e la mancanza di tumorigenicità – suggeriscono che gli studi di terapia genica cellulo-mediata utilizzando mioblasti primari possono ora essere ampiamente applicati a modelli murini di malattie muscolari e non muscolari umane.

Leave a Reply

Lascia un commento

Il tuo indirizzo email non sarà pubblicato.