Pancreapedia

Simbolo genico: RNASE1

1. Generale

La ribonucleasi pancreatica conosciuta anche come ribonucleasi A (RNase A) o ribonucleasi 1 (RNase1) è un enzima che catalizza la scomposizione dell’RNA e gioca un ruolo nella digestione dell’RNA nelle specie vertebrate. I primi lavori si sono concentrati sulla RNasi pancreatica bovina a causa della grande quantità presente nel pancreas. È stato descritto come l’enzima meglio studiato del 20° secolo con quattro premi Nobel assegnati per gli studi su questa proteina (20). A causa degli alti livelli presenti nel pancreas bovino, la RNasi1 è stata storicamente considerata come un enzima digestivo, ma con poco scopo negli esseri umani e in altri mammiferi non ruminanti (2) dove esiste a concentrazioni molto più basse. Tuttavia, la digestione dell’RNA avviene nell’intestino di tutte le specie e la RNasi1 e altri membri della sua superfamiglia sono ora noti per avere ulteriori funzioni nella difesa dell’ospite che saranno discusse più avanti.

Struttura e meccanismo d’azione

La RNasi1 bovina fu purificata e cristallizzata da Kunitz nel 1939 (16) e sequenziata da Smyth, Stein e Moore nel 1963 (30). Contiene 124 aminoacidi, un peso molecolare calcolato di 13.683 e un eccesso di residui basici che porta a un punto isoelettrico di 8,5 – 9,0. Contiene quattro legami disolfuro ed è stata usata come modello per studiare il ripiegamento delle proteine (22). È anche glicosilata sui residui di asparagina e la forma glicosilata è stata originariamente denominata RNasi B. A causa della glicosilazione e della struttura terziaria, si presenta sulla maggior parte dei gel SDS a 18 o 19 kDa. La RNasi 1 suina contiene 125 aminoacidi (26); la RNasi 1 umana contiene 3 aminoacidi in più al terminale carbossilico rispetto alla RNasi 1 bovina (4). La RNasi1 bovina è stato il primo enzima di cui è stata determinata la struttura tridimensionale. Ha una forma complessiva come un fagiolo con il sito attivo nella fessura che contiene His12, His119 e Lys41 (25). Altri siti di legame non catalitici aiutano l’enzima a formare un complesso con il suo substrato polimerico. RNase1 catalizza l’idrolisi dei legami 3′,5′-fosfodiesteri in RNA a singolo filamento quando la base sul lato 3′ è una pirimidina (7, 11, 23). Il processo è solitamente rappresentato come se avvenisse in due fasi, con la prima fase che coinvolge la formazione di un fosfodiestere ciclico e la seconda la sua idrolisi (23). La RNasi 1 non idrolizza il DNA perché manca di un gruppo 2′-OH. Questo le permette di essere usata per rimuovere la contaminazione da RNA dal DNA. Viene anche usata nei saggi di protezione dalla ribonucleasi. La RNasi 1 forma dei dimeri attraverso lo scambio di domini dei termini amminici mediante la formazione di legami sulfidrilici in modo tale da mantenere attivo ogni sito attivo (18). Pur mantenendo la funzione idrolitica i dimeri acquisiscono un’ulteriore attività biologica con dimeri, trimeri e tetrameri che possiedono attività antitumorale

Superfamiglia delle Ribonucleasi A

Il genoma umano codifica per 122 ribonucleasi separate. La superfamiglia RNAse A consiste di otto ribonucleasi “canoniche” con attività enzimatica e omologia strutturale alla RNasi A (15). Tutte sono proteine secretorie che condividono una struttura terziaria legata al disolfuro e sono in grado di degradare l’RNA. Tutte sono codificate in una regione stretta del cromosoma 14 sia negli esseri umani che nei topi (27) e si ritiene che abbiano avuto origine dalla duplicazione del gene (3, 31). Sebbene il gene contenga diversi esoni, la regione codificante è costituita da un solo esone. La comprensione del loro ruolo fisiologico è incompleta, ma la maggior parte sono importanti per la difesa dell’ospite e l’angiogenesi così come la digestione (9). Il primo membro ad essere descritto è la RNasi 1 che, oltre ad essere un enzima pancreatico, è prodotta in una varietà di cellule tra cui le cellule endoteliali vascolari dove, dopo la secrezione, degrada l’RNA polimerico vascolare e ha attività anti-HIV-1 (15). Le RNasi 2 e 3 sono proteine secretorie degli eosinofili denominate rispettivamente neurotossina derivata dagli eosinofili (EDN) e proteina cationica degli eosinofili (ECP) (15). La RNasi 4 è presente in diversi tessuti ma il suo ruolo fisiologico non è chiaro. La RNasi 5, nota anche come angiogenina, induce la crescita dei vasi sanguigni (10). La RNasi 7 è la RNasi più abbondante nella pelle, mentre la RNasi 8 è espressa nella placenta (15). Altri geni del cluster sono legati alle ribonucleasi (RNasi da 9 a 13) ma le loro proteine hanno mutazioni che impediscono l’attività della RNasi. Alcune delle RNasi secrete o i loro oligomeri possono entrare nelle cellule ed esercitare effetti citotossici specialmente sulle cellule tumorali.

Inibitore della ribonucleasi

L’inibitore della ribonucleasi mammifera (RI) è una proteina citosolica di 50 KDa che si lega con alta affinità e stechiometria 1:1 alla ribonucleasi pancreatica inattivandola (8, 17). È particolarmente abbondante nella placenta e nel fegato ed è stata usata per purificare la RNasi. Inibisce tutti i membri della famiglia delle RNasi A. La sua struttura tridimensionale è quella di un ferro di cavallo che contiene ripetizioni ricche di leucina. Anche se il ruolo biologico non è chiaro, dovrebbe legare e inattivare qualsiasi membro della famiglia delle RNasi A che sfugge alla via secretoria ed entra nel citoplasma.

2. Ruolo della ribonucleasi nel pancreas

La maggior parte delle cellule contiene concentrazioni millimolari di ribonucleotidi ma solo concentrazioni micromolari di deossiribonucleotidi (5). Quindi la dieta contiene una miscela di ribonucleoproteine, RNA e ribonucleotidi. Le nucleoproteine sono scomposte dalla proteasi pancreatica. La visione da manuale è che gli acidi nucleici della dieta sono scomposti dalla RNasi e DNasi pancreatica nell’intestino. Uno studio recente, tuttavia, ha dimostrato che la pepsina nello stomaco idrolizza anche l’acido nucleico, quindi questa digestione inizia lì (19). Gli alimenti ricchi di ribonucleoproteine includono carni organiche, frutti di mare e legumi (5).

La RNasi pancreatica (RNasi 1) è presente in tutti i pancreas dei vertebrati, ma la quantità varia notevolmente (2). I mammiferi con grandi quantità includono ungulati, roditori e marsupiali erbivori. Nella mucca, la RNasi costituisce il 20% dell’enzima digestivo; si pensa che questo requisito sia dovuto al grande carico di RNA che viene prodotto dai batteri della fermentazione ruminale. In altre specie, tra cui l’uomo, il cane, il gatto e i vertebrati inferiori, l’RNasi è presente in quantità molto inferiori e può rappresentare solo lo 0,5-1% degli enzimi pancreatici. Sebbene esistano solo pochi studi, la RNasi pancreatica in tutte le specie sembra scomporre l’acido nucleico alimentare nel lume intestinale in nucleotidi che vengono ulteriormente scomposti dalla fosfatasi alcalina intestinale e dalla 5’nucleotidasi in nucleosidi e basi azotate libere. Pertanto, la digestione degli acidi nucleici ha una fase luminale e una fase di confine a spazzola. Questi prodotti sono assorbiti dagli enterociti, ma la maggior parte è escreta nelle urine; alcuni sono utilizzati per la risintesi principalmente nello stato di digiuno (13, 21, 29). Normalmente l’80-90% dei nucleotidi viene assorbito e questi possono diventare essenziali in alcune malattie o in periodi di assunzione limitata o di rapida crescita (5).

La ribonucleasi viene sintetizzata nelle cellule acinari dall’ER ruvido, ripiegato e impacchettato in granuli zimogeni a partire da 20 giorni di gestazione nel ratto (33). Il ripiegamento avviene molto più rapidamente nelle cellule rispetto alla proteina isolata e, ad eccezione di una piccola quantità di dimero, qualsiasi proteina che non termina come monomero ripiegato viene degradata (12). Viene secreta nel mezzo parallelamente ad altri enzimi digestivi dai lobuli pancreatici e dagli acini stimolati con CCK o analoghi colinergici (14, 24, 28). La sintesi della RNasi 1 è ridotta nel diabete sperimentale del 50% ma molto meno della diminuzione dell’amilasi.

3. Strumenti per lo studio della Ribonucleasi1

a. Anticorpi

Biocompare (www.biocompare.com) elenca 394 anticorpi di ribonucleasi da 32 fornitori. Alcuni sono specifici per la specie mentre altri sono specifici per RNase1 o altri membri della famiglia. Non abbiamo testato nessuno di questi anticorpi.

b. Attività ribonucleasica

I primi saggi di ribonucleasi utilizzavano l’idrolisi dell’RNA del lievito; noi abbiamo utilizzato un saggio descritto da Anfinsen (1) per misurare la secrezione di ribonucleasi pancreatica da acini pancreatici di ratto isolati (24). Questi saggi però non sono specifici per la RNasi1 e hanno funzionato per lo studio della secrezione acinare pancreatica perché la RNasi1 è la forma principale presente negli acini pancreatici. È stato anche descritto un saggio che utilizza l’idrolisi della citidina 2′-3′-fosfato (6). Recentemente è stato sviluppato un saggio quantitativo di fluorescenza basato sul legame del bromuro di etidio all’RNA del lievito (32).

4. Riferimenti

  1. Anfinsen CB, Redfield RR, Choate WL, Page J, e Carroll WR. Studi sulla struttura lorda, legami incrociati e sequenze terminali in ribonucleasi. J Biol Chem 207: 201-210, 1954. PMID: 13152095
  2. Barnard EA. Funzione biologica della ribonucleasi pancreatica. Natura 221: 340-344, 1969. PMID: 4974403
  3. Beintema JJ, e Kleineidam RG. La superfamiglia delle ribonucleasi A: discussione generale. Cell Mol Life Sci 54: 825-832, 1998. PMID: 9760991
  4. Beintema JJ, Wietzes P, Weickmann JL, e Glitz DG. La sequenza di aminoacidi della ribonucleasi pancreatica umana. Anal Biochem 136: 48-64, 1984. PMID: 6201087
  5. Carver JD, e Walker, WA. Il ruolo dei nucleotidi nella nutrizione umana. J Nutr Biochem 6: 58 – 72, 1995.
  6. Crook EM, Mathias AP, e Rabin BR. Dosaggio spettrofotometrico della ribonucleasi pancreatica bovina mediante l’uso di citidina 2′:3′-fosfato. Biochem J 74: 234-238, 1960. PMID: 13812977
  7. Cuchillo CM, Nogues MV, e Raines RT. Ribonucleasi pancreatica bovina: cinquant’anni del primo meccanismo di reazione enzimatica. Biochimica 50: 7835-7841, 2011. PMID: 21838247
  8. Dickson KA, Haigis MC, e Raines RT. Ribonucleasi inibitore: struttura e funzione. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 80: 349-374, 2005. PMID: 16164979
  9. Dyer KD, e Rosenberg HF. La superfamiglia RNase a: generazione di diversità e difesa innata dell’ospite. Mol Divers 10: 585-597, 2006. PMID: 16969722
  10. Fett JW, Strydom DJ, Lobb RR, Alderman EM, Bethune JL, Riordan JF, e Vallee BL. Isolamento e caratterizzazione di angiogenina, una proteina angiogenica da cellule di carcinoma umano. Biochimica 24: 5480-5486, 1985. PMID: 4074709
  11. Findlay D, Herries DG, Mathias AP, Rabin BR, e Ross CA. Il sito attivo e il meccanismo d’azione della ribonucleasi pancreatica bovina. Natura 190: 781-784, 1961. PMID: 13699542
  12. Geiger R, Gautschi M, Thor F, Hayer A, e Helenius A. Folding, controllo di qualità, e la secrezione di ribonucleasi pancreatica in cellule vive. J Biol Chem 286: 5813-5822, 2011. PMID: 21156800
  13. Ho CY, Miller KV, Savaiano DA, Crane RT, Ericson KA, e Clifford AJ. Assorbimento e metabolismo delle purine somministrate per via orale in ratti alimentati e digiuni. J Nutr 109: 1377-1382, 1979. PMID: 458492
  14. Iwanij V, e Jamieson JD. Analisi biochimica delle proteine secretorie sintetizzate dal pancreas di ratto normale e dalle cellule tumorali acinari pancreatiche. J Cell Biol 95: 734-741, 1982. PMID: 6185502
  15. Koczera P, Martin L, Marx G, e Schuerholz T. La superfamiglia della ribonucleasi A negli esseri umani: RNasi canoniche come il fondamento dell’immunità innata. Int J Mol Sci 17: 2016. PMID: 27527162
  16. Kunitz M. Ribonucleasi cristallina. J Gen Physiol 24: 15-32, 1940. PMID: 19873197
  17. Lee FS, e Vallee BL. Struttura e azione della ribonucleasi dei mammiferi (angiogenina) inibitore. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 44: 1-30, 1993. PMID: 8434120
  18. Libonati M. Azioni biologiche degli oligomeri di ribonucleasi A. Cell Mol Life Sci 61: 2431-2436, 2004. PMID: 15526151
  19. Liu Y, Zhang Y, Dong P, An R, Xue C, Ge Y, Wei L, e Liang X. Digestione degli acidi nucleici inizia nello stomaco. Sci Rep 5: 11936, 2015. PMID: 26168909
  20. Marshall GR, Feng JA, e Kuster DJ. Ritorno al futuro: ribonucleasi A. Biopolimeri 90: 259-277, 2008. PMID: 17868092
  21. McAllan AB. La degradazione degli acidi nucleici in, e la rimozione dei prodotti di degradazione dal piccolo intestino di manzi. Br J Nutr 44: 99-112, 1980. PMID: 6158999
  22. Moore S, e Stein WH. Strutture chimiche di ribonucleasi pancreatica e deossiribonucleasi. Scienza 180: 458-464, 1973. PMID: 4573392
  23. Nogues MV, Vilanova M, e Cuchillo CM. La ribonucleasi A pancreatica bovina come modello di un enzima con più siti di legame del substrato. Biochim Biophys Acta 1253: 16-24, 1995. PMID: 7492594
  24. Otsuki M, e Williams JA. Effetto del diabete mellito sulla regolazione della secrezione enzimatica da acini pancreatici isolati di ratto. J Clin Invest 70: 148-156, 1982. PMID: 6177717
  25. Raines RT. Ribonucleasi A. Chem Rev 98: 1045-1066, 1998.
  26. Reinhold VN, Dunne FT, Wriston JC, Schwarz M, Sarda L, e Hirs CH. L’isolamento della ribonucleasi suina, una glicoproteina, dal succo pancreatico. J Biol Chem 243: 6482-6494, 1968. PMID: 5715511
  27. Samuelson LC, Wiebauer K, Howard G, Schmid RM, Koeplin D, e Meisler MH. Isolamento del gene della ribonucleasi murina Rib-1: struttura ed espressione specifica del tessuto nel pancreas e nella ghiandola parotide. Nucleic Acids Res 19: 6935-6941, 1991. PMID: 1840677
  28. Scheele GA, e Palade GE. Studi sul pancreas di cavia. Scarico parallelo delle attività enzimatiche esocrine. J Biol Chem 250: 2660-2670, 1975. PMID: 1123325
  29. Schwenk M, Hegazy E, e Lopez del Pino V. Uridina assorbimento da cellule epiteliali intestinali isolate di cavia. Biochim Biophys Acta 805: 370-374, 1984. PMID: 6210111
  30. Smyth DG, Stein WH, e Moore S. La sequenza dei residui di aminoacidi nella ribonucleasi pancreatica bovina: revisioni e conferme. J Biol Chem 238: 227-234, 1963. PMID: 13989651
  31. Sorrentino S. Le otto ribonucleasi umane “canoniche”: diversità molecolare, proprietà catalitiche e azioni biologiche speciali delle proteine dell’enzima. FEBS Lett 584: 2194-2200, 2010. PMID: 20388512
  32. Tripathy DR, Dinda AK, e Dasgupta S. Un semplice test per l’attività ribonucleasica delle ribonucleasi in presenza di bromuro di etidio. Biochimica anale 437: 126-129, 2013. PMID: 23499964
  33. Van Nest GA, MacDonald RJ, Raman RK e Rutter WJ. Proteine sintetizzate e secrete durante lo sviluppo del pancreas del ratto. J Cell Biol 86: 784-794, 1980. PMID: 7410479

Leave a Reply

Lascia un commento

Il tuo indirizzo email non sarà pubblicato.