Nanobody

4.3 Egydoménes antitestekkel tervezett BBB-n átjutó bsAbs

Az sdAbs az antitestek kis (15 kDa), monomer antigénkötő fragmentumai, amelyek a bsAbs “építőelemeként” számos előnyt biztosítanak más antitestfragmentumokkal szemben. A természetben a nehézláncú antitestek antigénkötő részeként fordulnak elő tevefélékben (VHH-nak nevezik) és porcos halakban (VNAR-nak nevezik), vagy hagyományos IgG-kből állíthatók elő monomer, stabil VH- vagy VL-domének kinyerésével vagy módosításával (Hamers-Casterman et al., 1993; Hussack et al., 2012; Kim et al., 2014; Nuttall, 2012; Ward, Güssow, Griffiths, Jones, & Winter, 1989). Az sdAbs-ok rendkívül stabilak és kompaktak, és képesek hozzáférni a fehérjékben lévő, a hagyományos IgG-k elől gyakran “elrejtett”, süllyesztett epitópokhoz, például receptorüregekhez vagy enzimek aktív helyeihez, és a hagyományos antitestekhez hasonló célpontkötési affinitást érhetnek el (Lauwereys et al., 1998; Staus et al., 2014). Ezek a monomer antigénkötő egységek nem párosodnak könnyűláncokkal, ami kiváló építőkövévé teszi őket a heterodimerizált bsAbs-oknak, mivel így elkerülhetők a nem megfelelő könnyűlánc-párosodásból adódó nehézségek (Hamers-Casterman és mtsai., 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). Heterodimer bsAbs-ok hozhatók létre úgy, hogy az egyik vagy mindkét “kar” sdAb, ez utóbbiak szerkezete hasonló a tevefélék nehézláncú antitestjeihez (3E. ábra). sdAbs-ok különböző mono-, bi- vagy tetravalens fúziókban is felhasználhatók hagyományos terápiás antitestekkel vagy Fab-okkal (3E. ábra). 3E), amelyek általában kisebb, kevésbé összetett molekulákat eredményeznek, összehasonlítva az scFv-kkel vagy Fab-okkal mint építőelemekkel előállított molekulákkal, amelyek általában biofizikailag jól viselkednek és könnyen előállíthatók (Holliger & Hudson, 2005). A VHH-k humanizálása, valamint az sdAbs-ok engineeringje jól le van írva, ami lehetővé teszi az optimális célpont-affinitással és kivételes biofizikai tulajdonságokkal rendelkező human(ized) sdAbs-ok könnyű előállítását (Vincke et al.,

A tevefélék VHH-jának, az FC5-nek a bispecifikus CNS-célú antitesteken belüli BBB-hordozóként való potenciális felhasználásának értékeléséhez az FC5 monovalens és bivalens fúzióit (N- és C-terminus) humán Fc-vel tervezték és értékelték in vitro és in vivo (Farrington és mtsai., 2014). A bivalens FC5Fc fúzió látszólagos kötési affinitása (Kdapp) a patkány BEC-hez 75 nM volt, míg a monovalens FC5Fc kötődése a mikromoláris tartományban volt. Az in vitro BBB-modellen keresztül történő látszólagos transzmigrációs sebesség (Papp), a szisztémásan beadott antitest-konstrukciók szérum/CSF farmakokinetikájából levezetett látszólagos CNS-expozíció és a kémiailag konjugált BBB-impermeábilis neuroaktív peptidek által kiváltott farmakológiai válaszok Hargreaves fájdalommodellben történő elemzései bizonyítékot szolgáltattak e nagy (75 kDa) antitestmolekulák FC5 által közvetített fokozott BBB-transzportjára: (1) az in vitro Papp-értékek ~ 200 cm/perc voltak mind a mono-, mind a bivalens N-terminális Fc-fúziós molekulák (FC5Fc) esetében, szemben a kontroll VHH A20 4-8 cm/perc értékével.1Fc vagy EG2Fc fúziókhoz képest; (2) az FC5Fc fúzió látszólagos CNS-expozíciója 30-szor nagyobb volt a kontroll domén antitest-Fc fúziókhoz képest; (3) az FC5Fc konjugátumok szisztémás farmakológiai hatékonysága a dalargin vagy galanin neuropeptidekkel Hargreaves gyulladásos fájdalommodellben akár 60-szor nagyobb volt a monomer FC5-neuropeptid konjugátumokhoz képest. Ezt az eredményt az FC5Fc-nek az FC5-neuropeptid-konjugátumokhoz képest hosszú keringési felezési idejének (~ 96 óra) tulajdonították; (4) különböző kontroll VHH-Fc neuropeptid-konjugátumok nem mutattak szisztémás hatékonyságot; (5) az FC5 fúziója az Fc C-terminusához csökkent BBB-átjutási képességet eredményezett. A TfR-célú BBB-hordozó antitestekkel ellentétben mind a mono-, mind a bivalens FC5Fc fúziós fehérjék hasonló transzcitózissebességet mutattak in vitro, hasonló plazma/CSF farmakokinetikai profilt és hasonló szisztémás hatékonyságot a farmakodinamikai modellben in vivo, a látszólagos kötési affinitás és a valencia különbségei ellenére (Farrington és mtsai., 2014). Ezek a vizsgálatok kimutatták, hogy a BBB-n átjutó egydoménes FC5 antitest használható platform BBB-hordozóként mind heterodimerizált “fél-antitestek”, mind a hagyományos IgG-khez könnyebben skálázható bi- vagy tetravalens fúzió formájában (Farrington et al., 2014).

A VHH-k mint BBB-hordozók másik potenciális előnye a szélsőséges biofizikai kihívásokkal, például a hőmérséklettel és a pH-val, valamint a proteázok lebontásával szembeni természetes ellenálló képességük (Kim et al., 2014), amellyel gyakran találkozunk a különböző endocitikus kompartmentekben a transzcitózis során. Mind az FC5, mind az FC5Fc fúziók klatrin bevonatú vezikulákon keresztül internalizálódnak a BEC-be, és a korai endoszómákba rendeződnek. Érdekes módon az FC5-ről azt is megállapították, hogy serkenti az extracelluláris mikrovezikulumok (exoszómák) kioldódását a BEC-ből (Haqqani, Caram-Salas, et al., 2013; Haqqani, Delaney, et al., 2013), amelyben Western blot és célzott tömegspektrometria segítségével mind az FC5-öt, mind feltételezett receptorának, a Cdc50A-nak megnövekedett szintjét kimutatták. Ez a vizsgálat azt sugallta, hogy a levetett exoszómák lehetnek az RMT-útvonal végső vezikulái, amelyek az abluminális felszínről szabadulnak fel, és a receptor-antitest-komplexet hordozzák (sematikusan a 4. ábrán látható). Az RMT-útvonalnak és az exoszóma-képződésnek van néhány figyelemre méltó hasonlósága. Az exoszómák első felfedezésében vázoltak szerint egy anti-TfR antitestet elektronmikroszkópiával követtek nyomon retikulocitákban (Théry, 2011) a sejtek felszínéről a klatrinnal bevont gödrökbe, a korai endoszómák belsejébe, a multivezikuláris endoszómák belső vezikuláinak felszínén és végül a felszabaduló exoszómákon a multivezikuláris endoszómák plazmamembránnal való fúzióját követően (4. ábra). Úgy tűnik, hogy az RMT hasonló módon bontakozik ki, és a BEC extracelluláris mikrovezikulumokról kimutatták, hogy számos olyan receptort tartalmaznak, amelyekről ismert, hogy RMT-n keresztül makromolekulákat szállítanak át a BBB-n, beleértve a TfR-t, LRP-ket, LDLR-t és IR-t (Haqqani, Delaney és mtsai., 2013).

A leírt vizsgálatokból nyilvánvalónak kell lennie, hogy a CNS-célzó bsAb-k BBB-hordozó karja gondos optimalizálást igényel minden egyes RMT-receptor esetében. A CNS-célú bsAb-k tervezésével kapcsolatos fontos megfontolásokat az alábbiakban a TfR-BACE1 bsAb fejlesztéséből és az FC5-tel, mint BBB-hordozó antitesttel végzett saját munkánkból levont “tanulságok” fényében tárgyaljuk.

Leave a Reply

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.