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4.3 BsAbs traversant la BHE conçus avec des anticorps à domaine unique

sdAbs sont de petits (15 kDa) fragments d’anticorps monomères se liant à l’antigène qui offrent divers avantages par rapport aux autres fragments d’anticorps en tant que « blocs de construction » pour les bsAbs. Ils sont présents dans la nature en tant que partie de liaison à l’antigène des anticorps à chaîne lourde chez les camélidés (appelés VHH) et les poissons cartilagineux (appelés VNAR) ou peuvent être générés à partir d’IgG classiques en obtenant ou en concevant des domaines VH ou VL monomères et stables (Hamers-Casterman et al., 1993 ; Hussack et al., 2012 ; Kim et al, 2014 ; Nuttall, 2012 ; Ward, Güssow, Griffiths, Jones, & Winter, 1989). Les sdAbs sont très stables et compacts et ils peuvent accéder à des épitopes en retrait dans les protéines, comme les cavités des récepteurs ou les sites actifs des enzymes, qui sont souvent  » cachés  » des IgG conventionnelles et peuvent atteindre des affinités de liaison à la cible comparables à celles des anticorps conventionnels (Lauwereys et al., 1998 ; Staus et al., 2014). Ces unités monomères de liaison à l’antigène ne s’apparient pas avec les chaînes légères, ce qui en fait d’excellents blocs de construction pour les bsAbs hétérodimérisés car ils évitent les difficultés liées à un mauvais appariement des chaînes légères (Hamers-Casterman et al., 1993 ; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). Il est possible de créer des bsAbs hétérodimériques dont l’un ou les deux  » bras  » sont des sdAb, ces derniers ayant une structure similaire à celle des anticorps à chaîne lourde des camélidés (Fig. 3E). Les sdAbs peuvent également être utilisés dans diverses fusions mono-, bi- ou tétravalentes avec des anticorps thérapeutiques conventionnels ou des Fabs (Fig. 3E), ce qui donne généralement des molécules plus petites et moins complexes, par rapport à celles générées avec des scFv ou des Fab comme éléments de base, qui ont tendance à avoir un bon comportement biophysique et à être faciles à produire (Holliger & Hudson, 2005). L’humanisation des VHH ainsi que l’ingénierie des sdAbs sont bien décrites, permettant de générer facilement des sdAbs human(ized) avec une affinité optimale pour la cible et des propriétés biophysiques exceptionnelles (Vincke et al…, 2009).

Pour évaluer l’utilisation potentielle du VHH FC5 de camélidé comme transporteur de la BHE au sein d’anticorps bispécifiques ciblant le SNC, des fusions monovalentes et bivalentes (extrémités N et C) de FC5 avec le Fc humain ont été conçues et évaluées in vitro et in vivo (Farrington et al., 2014). L’affinité de liaison apparente (Kdapp) pour les CEB de rat de la fusion FC5Fc bivalente était de 75 nM, tandis que la liaison du FC5Fc monovalent était de l’ordre du micromolaire. Les analyses des taux de transmigration apparents (Papp) à travers un modèle de BHE in vitro, l’exposition apparente du SNC dérivée de la pharmacocinétique du sérum/FCS des constructions d’anticorps administrées par voie systémique, et les réponses pharmacologiques provoquées par des peptides neuroactifs chimiquement conjugués et imperméables à la BHE dans le modèle de douleur de Hargreaves, ont fourni la preuve d’un transport BBB amélioré de ces grandes molécules d’anticorps (75 kDa) médiées par le FC5 : (1) les valeurs de Papp in vitro étaient de ~ 200 cm/min pour les molécules de fusion Fc N-terminal mono- et bivalentes (FC5Fc) par rapport à 4-8 cm/min pour les molécules de contrôle VHH A20.1Fc ou EG2Fc ; (2) l’exposition apparente au SNC de la fusion FC5Fc était 30 fois supérieure à celle des fusions anticorps-Fc du domaine témoin ; (3) la puissance pharmacologique systémique des conjugués FC5Fc avec les neuropeptides dalargin ou galanin dans le modèle de douleur inflammatoire de Hargreaves était jusqu’à 60 fois supérieure à celle des conjugués FC5-neuropeptide monomères. Ce résultat a été attribué à la longue demi-vie circulatoire (~ 96 h) du FC5Fc- par rapport aux conjugués FC5-neuropeptide ; (4) divers conjugués neuropeptidiques VHH-Fc témoins n’ont montré aucune efficacité systémique ; (5) la fusion du FC5 à l’extrémité C-terminale du Fc a entraîné une capacité atténuée de franchissement de la BHE. Contrairement aux anticorps porteurs de la BHE ciblant le TfR, les protéines de fusion FC5Fc mono- et bivalentes ont montré un taux de transcytose similaire in vitro, des profils pharmacocinétiques plasma/CSF similaires et une puissance systémique similaire dans le modèle pharmacodynamique in vivo, malgré des différences d’affinité et de valence de liaison apparentes (Farrington et al., 2014). Ces études ont démontré que l’anticorps à domaine unique FC5, qui traverse la BHE, peut être utilisé comme plateforme porteuse de la BHE à la fois, sous forme de  » demi-anticorps  » hétérodimérisés et sous forme de fusion bi- ou tétravalente, plus facilement évolutive, avec des IgG conventionnelles (Farrington et al, 2014).

Un autre avantage potentiel des HVH en tant que transporteurs de BHE est leur résistance naturelle aux défis biophysiques extrêmes, tels que la température et le pH, ainsi qu’à la dégradation par les protéases (Kim et al., 2014), souvent rencontrée dans divers compartiments endocytiques pendant la transcytose. Les fusions FC5 et FC5Fc sont toutes deux internalisées dans les BEC via des vésicules recouvertes de clathrine, et sont triées vers les endosomes précoces. Il est intéressant de noter que FC5 stimule également l’excrétion de microvésicules extracellulaires (exosomes) à partir de BEC (Haqqani, Caram-Salas, et al., 2013 ; Haqqani, Delaney, et al., 2013) où FC5 et des niveaux accrus de son récepteur putatif Cdc50A ont été détectés par Western blot et spectrométrie de masse ciblée. Cette étude suggère que les exosomes peuvent être la dernière vésicule de la voie RMT libérée de la surface abluminale transportant le complexe récepteur-anticorps (représenté schématiquement sur la figure 4). La voie RMT et la formation des exosomes présentent des similitudes notables. Comme indiqué dans la première découverte des exosomes, un anticorps anti-TfR a été suivi par microscopie électronique dans les réticulocytes (Théry, 2011) depuis la surface des cellules, dans les fosses recouvertes de clathrine, à l’intérieur des endosomes précoces, à la surface des vésicules internes des endosomes multivésiculaires et enfin sur les exosomes libérés après la fusion des endosomes multivésiculaires avec la membrane plasmique (Fig. 4). La RMT semble se dérouler de manière similaire et il a été démontré que les microvésicules extracellulaires de BEC contiennent plusieurs récepteurs connus pour transporter des macromolécules à travers la BHE via la RMT, y compris TfR, LRPs, LDLR et IR (Haqqani, Delaney, et al., 2013).

D’après les études décrites, il devrait être évident que le bras porteur de la BHE des bsAb ciblant le SNC nécessite une optimisation minutieuse pour chaque récepteur RMT. Des considérations importantes dans la conception de bsAbs ciblant le SNC sont discutées ci-dessous au vu des  » leçons apprises  » du développement de bsAb TfR-BACE1 et de notre propre travail avec FC5 comme anticorps porteur de la BHE.

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