Pancreapedia

Gene Symbol: RNASE1

1. Yleistä

Haiman ribonukleaasi, joka tunnetaan myös nimellä ribonukleaasi A (RNaasi A) tai ribonukleaasi 1 (RNaasi1), on entsyymi, joka katalysoi RNA:n hajoamista ja jolla on rooli RNA:n pilkkomisessa selkärankaisilla. Varhaisessa työssä keskityttiin naudan haiman RNaasiin, koska sitä on haimassa runsaasti. Sitä on kuvattu 1900-luvun parhaiten tutkituksi entsyymiksi, ja tätä proteiinia koskevista tutkimuksista on myönnetty neljä Nobel-palkintoa (20). Naudan haimassa esiintyvien suurten pitoisuuksien vuoksi RNaasi1:tä pidettiin historiallisesti ruoansulatusentsyyminä, mutta sillä ei ollut juurikaan merkitystä ihmisillä ja muilla nisäkkäillä, jotka eivät ole märehtijöitä (2), joissa sitä esiintyy paljon pienempinä pitoisuuksina. RNA:n pilkkomista tapahtuu kuitenkin kaikkien lajien suolistossa, ja RNaasi1:llä ja muilla sen superperheen jäsenillä tiedetään nyt olevan muitakin tehtäviä isännän puolustuksessa, joita käsitellään myöhemmin.

Rakenne ja vaikutusmekanismi

Nautojen RNaasi1:n puhdisti ja kiteytti Kunitz vuonna 1939 (16), ja Smyth, Stein ja Moore sekvensoivat sen vuonna 1963 (30). Se sisältää 124 aminohappoa, sen laskennallinen molekyylipaino on 13 683 ja siinä on liikaa emäksisiä jäämiä, minkä vuoksi sen isoelektrinen piste on 8,5-9,0. Se sisältää neljä disulfidisidisidosta, ja sitä on käytetty mallina proteiinien taittumisen tutkimisessa (22). Se on myös glykosyloitunut asparagiinijäännöksillä, ja glykosyloitunutta muotoa kutsuttiin alun perin RNaasi B:ksi. Glykosylaation ja tertiäärirakenteen vuoksi se kulkee useimmilla SDS-geeleillä 18 tai 19 kDa:n pituisena. Sian RNaasi 1 sisältää 125 aminohappoa (26); ihmisen RNaasi 1 sisältää kolme aminohappoa enemmän karboksyyliterminaalissa kuin naudan RNaasi 1 (4). Naudan RNaasi1 oli ensimmäinen entsyymi, jonka kolmiulotteinen rakenne määritettiin. Sen yleismuoto muistuttaa munuaispavun muotoa, ja sen aktiivinen keskus on halkio, jossa on His12, His119 ja Lys41 (25). Muut ei-katalyyttiset sitoutumiskohdat auttavat entsyymiä muodostamaan kompleksin polymeerisen substraatinsa kanssa. RNaasi1 katalysoi yksisäikeisen RNA:n 3′,5′-fosfodiesterisidosten hydrolyysiä, kun 3′-puolella oleva emäs on pyrimidiini (7, 11, 23). Prosessi esitetään yleensä tapahtuvan kahdessa vaiheessa, joista ensimmäisessä vaiheessa muodostuu syklinen fosfodiesteri ja toisessa se hydrolysoituu (23). RNaasi 1 ei hydrolysoida DNA:ta, koska siltä puuttuu 2′-OH-ryhmä. Tämän ansiosta sitä voidaan käyttää RNA-kontaminaation poistamiseen DNA:sta. Sitä käytetään myös ribonukleaasisuojausmäärityksissä. RNaasi 1 muodostaa dimeerejä vaihtamalla aminoterminaalien domeeneja sulfhydriilisidoksia muodostamalla siten, että kukin aktiivinen kohta pysyy aktiivisena (18). Samalla kun dimeerit säilyttävät hydrolyyttisen toimintansa, ne saavat ylimääräistä biologista aktiivisuutta, sillä dimeereillä, trimeereillä ja tetrameereillä on kasvainvastainen aktiivisuus

Ribonukleaasi A:n superperhe

Ihmisen genomi koodaa 122 erillistä ribonukleaasia. RNAse A -superperhe koostuu kahdeksasta ”kanonisesta” ribonukleaasista, joilla on entsymaattinen aktiivisuus ja rakenteellinen homologia RNaasi A:n kanssa (15). Kaikki ovat erittäviä proteiineja, joilla on yhteinen disulfidisidoksinen tertiäärirakenne ja jotka pystyvät hajottamaan RNA:ta. Kaikkia koodataan sekä ihmisillä että hiirillä kromosomin 14 tiukalla alueella (27), ja niiden uskotaan saaneen alkunsa geenien monistumisesta (3, 31). Vaikka geenissä on useita eksoneja, koodaava alue muodostuu yhdestä eksonista. Ymmärrys niiden fysiologisesta tehtävästä on puutteellinen, mutta useimmat niistä ovat tärkeitä isännän puolustuksen ja angiogeneesin sekä ruoansulatuksen kannalta (9). Ensimmäinen kuvattu jäsen on RNaasi 1, jota sen lisäksi, että se on haiman entsyymi, sitä tuotetaan useissa soluissa, myös verisuonten endoteelisoluissa, joissa se erittymisen jälkeen hajottaa verisuonten polymeeristä RNA:ta ja jolla on HIV-1:n vastaista aktiivisuutta (15). RNaasi 2 ja 3 ovat eosinofiilien erittäviä proteiineja, joita kutsutaan vastaavasti eosinofiilistä peräisin olevaksi neurotoksiiniksi (EDN) ja eosinofiilien kationiseksi proteiiniksi (ECP) (15). RNaasi 4:ää esiintyy useissa kudoksissa, mutta sen fysiologinen tehtävä on epäselvä. RNaasi 5, joka tunnetaan myös nimellä angiogeniini, indusoi verisuonten kasvua (10). RNaasi 7 on runsain RNaasi ihossa, kun taas RNaasi 8 ilmentyy istukassa (15). Klusterin muut geenit liittyvät ribonukleaaseihin (RNaasi 9-13), mutta niiden proteiineissa on mutaatioita, jotka estävät RNaasiaktiivisuuden. Osa erittyvistä RNaaseista tai niiden oligomeereistä voi päästä soluihin ja vaikuttaa sytotoksisesti erityisesti kasvainsoluihin.

Ribonukleaasi-inhibiittori

Nisäkkäiden ribonukleaasi-inhibiittori (RI) on sytosolista peräisin oleva 50 KDa:n proteiini, joka sitoutuu suurella affiniteetilla ja stoikiometriassaan 1:1 haiman ribonukleaasiin ja inaktivoi sitä siten (8, 17). Sitä esiintyy erityisen runsaasti istukassa ja maksassa, ja sitä on käytetty RNaasin puhdistamiseen. Se inhiboi kaikkia RNaasi A -perheen jäseniä. Sen kolmiulotteinen rakenne on hevosenkengän muotoinen ja sisältää leusiinirikkaita toistoja. Vaikka sen biologinen tehtävä ei olekaan selvä, sen pitäisi sitoa ja inaktivoida kaikki RNaasi A -perheen jäsenet, jotka pakenevat sekretorista reittiä ja pääsevät sytoplasmaan.

2. Ribonukleaasin rooli haimassa

Useimmissa soluissa on millimolaarisia konsentraatioita ribonukleotideja, mutta vain mikromolaarisia konsentraatioita deoksiribonukleotideja (5). Näin ollen ravinto sisältää ribonukleoproteiinin, RNA:n ja ribonukleotidien sekoitusta. Nukleoproteiinit hajotetaan haiman proteaasin avulla. Oppikirjojen mukaan ravinnon nukleiinihapot hajotetaan suolistossa haiman RNaasin ja DNaasin avulla. Tuore tutkimus on kuitenkin osoittanut, että myös mahalaukun pepsiini hydrolysoi nukleiinihappoja, joten pilkkominen alkaa sieltä (19). Ribonukleoproteiineja runsaasti sisältäviä elintarvikkeita ovat muun muassa elinliha, äyriäiset ja palkokasvit (5).

Haiman RNaasia (RNaasi 1) on kaikissa selkärankaisten haimoissa, mutta sen määrä vaihtelee suuresti (2). Nisäkkäisiin, joilla on suuria määriä, kuuluvat sorkka- ja kavioeläimet, jyrsijät ja kasvinsyöjäeläimet. Lehmällä RNaasin osuus ruoansulatusentsyymistä on 20 prosenttia; tämän vaatimuksen uskotaan johtuvan suuresta RNA-kuormasta, jota bakteerit tuottavat märehtijöiden käymisestä. Muilla lajeilla, kuten ihmisillä, koirilla, kissoilla ja alemmilla selkärankaisilla, RNaasia on paljon vähemmän, ja sen osuus haiman entsyymeistä voi olla vain 0,5-1 prosenttia. Vaikka tutkimuksia on tehty vain vähän, haiman RNaasi näyttää kaikilla lajeilla hajottavan ravinnosta saatua nukleiinihappoa suoliston luumenissa nukleotideiksi, jotka suoliston emäksinen fosfataasi ja 5′-nukleotidaasi hajottavat edelleen nukleosideiksi ja vapaiksi typpiemäksiksi. Nukleiinihappojen pilkkoutumisessa on siis luminaalinen ja harjan reunavaihe. Nämä tuotteet imeytyvät enterosyytteihin, mutta suurin osa niistä erittyy virtsaan; osa käytetään uudelleen synteesiin pääasiassa paastotilassa (13, 21, 29). Normaalisti 80-90 % nukleotideista imeytyy, ja niistä voi tulla välttämättömiä tietyissä sairauksissa tai rajoitetun saannin tai nopean kasvun aikana (5).

Ribonukleaasi syntetisoituu akinaarisoluissa karkean ER:n toimesta, taittuu ja pakkautuu zymogeenirakeisiin alkaen 20 päivän tiineydestä rotalla (33). Taittuminen tapahtuu soluissa paljon nopeammin kuin eristetyssä proteiinissa, ja pientä dimeerimäärää lukuun ottamatta kaikki proteiinit, jotka eivät pääty taittuneeksi monomeeriksi, hajoavat (12). CCK:lla tai kolinergisillä analogeilla stimuloiduista haimalohkoista ja haimahaarakkeista se erittyy väliaineeseen samanaikaisesti muiden ruoansulatusentsyymien kanssa (14, 24, 28). RNaasi 1:n synteesi vähenee kokeellisessa diabeteksessa 50 %, mutta paljon vähemmän kuin amylaasin väheneminen.

3. Työkaluja ribonukleaasi1:n tutkimiseen

a. Vasta-aineet

Biocompare (www.biocompare.com) listaa 394 ribonukleaasin vasta-ainetta 32 toimittajalta. Osa vasta-aineista on lajispesifisiä, kun taas toiset ovat spesifisiä RNaasi1:lle tai muille perheenjäsenille. Emme ole testanneet mitään näistä vasta-aineista.

b. Ribonukleaasiaktiivisuus

Varhaisissa ribonukleaasimäärityksissä käytettiin hiivan RNA:n hydrolyysiä; käytimme Anfinsenin (1) kuvaamaa määritystä mittaamaan haiman ribonukleaasin erittymistä eristetyistä rotan haima-apinoista (24). Nämä määritykset eivät kuitenkaan ole spesifisiä RNaasi1:lle, ja ne soveltuivat haiman okahaarakkeiden erityksen tutkimiseen, koska RNaasi1 on haiman okahaarakkeissa esiintyvä päämuoto. On myös kuvattu määritys, jossa käytetään sytidiini-2′-3′-fosfaatin hydrolyysiä (6). Äskettäin kehitettiin kvantitatiivinen fluoresenssimääritys, joka perustuu etidiumbromidin sitoutumiseen hiivan RNA:han (32).

4. Viitteet

  1. Anfinsen CB, Redfield RR, Choate WL, Page J ja Carroll WR. Tutkimuksia ribonukleaasin bruttorakenteesta, ristisidoksista ja päätesekvensseistä. J Biol Chem 207: 201-210, 1954. PMID: 13152095
  2. Barnard EA. Haiman ribonukleaasin biologinen toiminta. Nature 221: 340-344, 1969. PMID: 4974403
  3. Beintema JJ ja Kleineidam RG. Ribonukleaasi A:n superperhe: yleistä keskustelua. Cell Mol Life Sci 54: 825-832, 1998. PMID: 9760991
  4. Beintema JJ, Wietzes P, Weickmann JL ja Glitz DG. Ihmisen haiman ribonukleaasin aminohapposekvenssi. Anal Biochem 136: 48-64, 1984. PMID: 6201087
  5. Carver JD, ja Walker, WA. Nukleotidien merkitys ihmisen ravitsemuksessa. J Nutr Biochem 6: 58 – 72, 1995.
  6. Crook EM, Mathias AP, ja Rabin BR. Naudan haiman ribonukleaasin spektrofotometrinen määritys sytidiini-2′:3′-fosfaatin avulla. Biochem J 74: 234-238, 1960. PMID: 13812977
  7. Cuchillo CM, Nogues MV ja Raines RT. Naudan haiman ribonukleaasi: viisikymmentä vuotta ensimmäisestä entsymaattisesta reaktiomekanismista. Biochemistry 50: 7835-7841, 2011. PMID: 21838247
  8. Dickson KA, Haigis MC ja Raines RT. Ribonukleaasi-inhibiittori: rakenne ja toiminta. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 80: 349-374, 2005. PMID: 16164979
  9. Dyer KD, ja Rosenberg HF. RNaasi a -superperhe: monimuotoisuuden tuottaminen ja synnynnäinen isäntäpuolustus. Mol Divers 10: 585-597, 2006. PMID: 16969722
  10. Fett JW, Strydom DJ, Lobb RR, Alderman EM, Bethune JL, Riordan JF ja Vallee BL. Angiogeniinin, angiogeenisen proteiinin eristäminen ja karakterisointi ihmisen karsinoomasoluista. Biochemistry 24: 5480-5486, 1985. PMID: 4074709
  11. Findlay D, Herries DG, Mathias AP, Rabin BR ja Ross CA. Naudan haiman ribonukleaasin aktiivinen paikka ja vaikutusmekanismi. Nature 190: 781-784, 1961. PMID: 13699542
  12. Geiger R, Gautschi M, Thor F, Hayer A ja Helenius A. Folding, quality control, and secretion of pancreatic ribonuclease in live cells. J Biol Chem 286: 5813-5822, 2011. PMID: 21156800
  13. Ho CY, Miller KV, Savaiano DA, Crane RT, Ericson KA ja Clifford AJ. Suun kautta annettujen puriinien imeytyminen ja metabolia ruokituilla ja paastoavilla rotilla. J Nutr 109: 1377-1382, 1979. PMID: 458492
  14. Iwanij V, ja Jamieson JD. Biokemiallinen analyysi rotan normaalin haiman ja haiman acinarikasvainsolujen syntetisoimista sekretorisista proteiineista. J Cell Biol 95: 734-741, 1982. PMID: 6185502
  15. Koczera P, Martin L, Marx G ja Schuerholz T. The Ribonuclease A Superfamily in Humans: Canonical RNases as the Buttress of Innate Immunity. Int J Mol Sci 17: 2016. PMID: 27527162
  16. Kunitz M. Kiteinen ribonukleaasi. J Gen Physiol 24: 15-32, 1940. PMID: 19873197
  17. Lee FS ja Vallee BL. Nisäkkään ribonukleaasin (angiogeniinin) estäjän rakenne ja toiminta. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 44: 1-30, 1993. PMID: 8434120
  18. Libonati M. Biological actions of the oligomers of the ribonuclease A. Cell Mol Life Sci 61: 2431-2436, 2004. PMID: 15526151
  19. Liu Y, Zhang Y, Dong P, An R, Xue C, Ge Y, Wei L ja Liang X. Nukleiinihappojen pilkkominen alkaa vatsassa. Sci Rep 5: 11936, 2015. PMID: 26168909
  20. Marshall GR, Feng JA ja Kuster DJ. Takaisin tulevaisuuteen: ribonukleaasi A. Biopolymers 90: 259-277, 2008. PMID: 17868092
  21. McAllan AB. Nukleiinihappojen hajoaminen ja hajoamistuotteiden poistaminen härän ohutsuolesta. Br J Nutr 44: 99-112, 1980. PMID: 6158999
  22. Moore S ja Stein WH. Haiman ribonukleaasin ja deoksiribonukleaasin kemialliset rakenteet. Science 180: 458-464, 1973. PMID: 4573392
  23. Nogues MV, Vilanova M ja Cuchillo CM. Naudan haiman ribonukleaasi A sellaisen entsyymin mallina, jolla on useita substraatin sitoutumiskohtia. Biochim Biophys Acta 1253: 16-24, 1995. PMID: 7492594
  24. Otsuki M, ja Williams JA. Diabeteksen vaikutus entsyymin erityksen säätelyyn eristetyissä rotan haiman aciniissä. J Clin Invest 70: 148-156, 1982. PMID: 6177717
  25. Raines RT. Ribonukleaasi A. Chem Rev 98: 1045-1066, 1998.
  26. Reinhold VN, Dunne FT, Wriston JC, Schwarz M, Sarda L ja Hirs CH. Sian ribonukleaasin, glykoproteiinin, eristäminen haimamehusta. J Biol Chem 243: 6482-6494, 1968. PMID: 5715511
  27. Samuelson LC, Wiebauer K, Howard G, Schmid RM, Koeplin D ja Meisler MH. Hiiren ribonukleaasigeenin Rib-1 eristäminen: rakenne ja kudospesifinen ilmentyminen haimassa ja parotidirauhasessa. Nucleic Acids Res 19: 6935-6941, 1991. PMID: 1840677
  28. Scheele GA ja Palade GE. Tutkimuksia marsun haimasta. Eksokriinisten entsyymiaktiivisuuksien rinnakkaispurkautuminen. J Biol Chem 250: 2660-2670, 1975. PMID: 1123325
  29. Schwenk M, Hegazy E, and Lopez del Pino V. Uridine uptake by isolated intestinal epithelial cells of guinea pig. Biochim Biophys Acta 805: 370-374, 1984. PMID: 6210111
  30. Smyth DG, Stein WH ja Moore S. The sequence of amino acid residues in bovine pancreatic ribonuclease: revisions and confirmations. J Biol Chem 238: 227-234, 1963. PMID: 13989651
  31. Sorrentino S. Kahdeksan ihmisen ”kanonista” ribonukleaasia: molekulaarinen monimuotoisuus, katalyyttiset ominaisuudet ja entsyymiproteiinien erityiset biologiset vaikutukset. FEBS Lett 584: 2194-2200, 2010. PMID: 20388512
  32. Tripathy DR, Dinda AK ja Dasgupta S. Yksinkertainen määritys ribonukleaasien ribonukleaasiaktiivisuudelle etidiumbromidin läsnäollessa. Anal Biochem 437: 126-129, 2013. PMID: 23499964
  33. Van Nest GA, MacDonald RJ, Raman RK ja Rutter WJ. Rotan haiman kehityksen aikana syntetisoituvat ja erittyvät proteiinit. J Cell Biol 86: 784-794, 1980. PMID: 7410479

Leave a Reply

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.