Nanobody

4.3 BBB:n läpäisevät bsAb:t, jotka on kehitetty yhden domeenin vasta-aineilla

sdAb:t ovat vasta-aineiden pieniä (15 kDa), monomeerisiä, antigeeniä sitovia vasta-ainefragmentteja, joilla on monia etuja muihin vasta-ainefragmentteihin nähden, kun ne ovat bsAb:ien ”rakennuspalikoita”. Niitä esiintyy luonnossa raskaan ketjun vasta-aineiden antigeeniä sitovana osana kamelieläinlajeissa (nimeltään VHH) ja rustokaloissa (nimeltään VNAR), tai niitä voidaan tuottaa tavanomaisista IgG:istä hankkimalla tai muokkaamalla monomeerisia, stabiileja VH- tai VL-domeeneja (Hamers-Casterman ym., 1993; Hussack ym., 2012; Kim ym, 2014; Nuttall, 2012; Ward, Güssow, Griffiths, Jones, & Winter, 1989). sdAb:t ovat erittäin stabiileja ja kompakteja, ja ne pääsevät käsiksi proteiineissa oleviin syvennettyihin epitooppeihin, kuten reseptorionteloihin tai entsyymien aktiivisiin alueisiin, jotka ovat usein ”piilossa” tavanomaisilta IgG:ltä, ja niillä voidaan saavuttaa tavanomaisiin vasta-aineisiin verrattavissa olevia kohteen sitoutumisaffiniteetteja (Lauwereys ym., 1998; Staus ym., 2014). Nämä monomeeriset antigeeniä sitovat yksiköt eivät parity kevytketjujen kanssa, mikä tekee niistä erinomaisia rakennuspalikoita heterodimeroituneille bsAbs:ille, koska niillä vältetään epäasianmukaisesta kevytketjujen parityöskentelystä aiheutuvat vaikeudet (Hamers-Casterman ym., 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). Heterodimeerisiä bsAb:ita voidaan luoda siten, että toinen tai molemmat ”varret” ovat sdAb:ita, joista jälkimmäinen on rakenteeltaan samankaltainen kuin kamelidien raskaanketjuiset vasta-aineet (kuva 3E). sdAb:ita voidaan käyttää myös erilaisina mono-, kaksi- tai tetravalenttisina fuusioina tavanomaisten terapeuttisten vasta-aineiden tai Fab:ien kanssa (kuva 3E). 3E, jolloin tuloksena on yleensä pienempiä ja vähemmän monimutkaisia molekyylejä verrattuna molekyyleihin, jotka on tuotettu käyttämällä scFv:tä tai Fab:ia rakennuspalikoina ja jotka ovat yleensä biofysikaalisesti hyvin käyttäytyviä ja helposti tuotettavissa (Holliger & Hudson, 2005). VHH:iden humanisointi sekä sdAbien suunnittelu on kuvattu hyvin, minkä ansiosta voidaan helposti tuottaa human(ized) sdAbeja, joilla on optimaalinen kohdeaffiniteetti ja poikkeukselliset biofysikaaliset ominaisuudet (Vincke et al.,

Kaameloidien VHH FC5:n mahdollisen käytön arvioimiseksi BBB-kantajana bispesifisissä keskushermostoon kohdistuvissa vasta-aineissa suunniteltiin ja arvioitiin in vitro ja in vivo FC5:n monovalenttiset ja bivalenttiset fuusiot (N- ja C-terminaali) ihmisen Fc:n kanssa (Farrington ym., 2014). Bivalentin FC5Fc-fuusion näennäinen sitoutumisaffiniteetti (Kdapp) rotan BEC:hen oli 75 nM, kun taas monovalentin FC5Fc:n sitoutuminen oli mikromolaarisella alueella. Analyysit näennäisistä siirtymisnopeuksista (Papp) in vitro BBB-mallissa, systeemisesti annosteltujen vasta-ainekonstruktioiden seerumin/CSF-farmakokinetiikasta johdetusta näennäisestä CNS-altistuksesta ja farmakologisista vasteista, joita kemiallisesti konjugoidut BBB:tä läpäisemättömät neuroaktiiviset peptidit saivat aikaan Hargreavesin kipumallissa, tarjosivat todisteen näiden suurten (75 kDa:n suuruisten) vasta-ainemolekyylien tehostuneesta BBB:n kautta tapahtuvasta kuljetuksesta FC5:llä välitettynä: (1) in vitro Papp-arvot olivat ~ 200 cm/min sekä mono- että bivalenttien N-terminaalisten Fc-fuusiomolekyylien (FC5Fc) osalta verrattuna 4-8 cm/min kontrolli VHH A20:n osalta.1Fc- tai EG2Fc-fuusioihin verrattuna; (2) FC5Fc-fuusion näennäinen CNS-altistus oli 30-kertainen verrattuna kontrollidomeenin vasta-aine-Fc-fuusioihin; (3) FC5Fc-konjugaattien systeeminen farmakologinen farmakologinen teho neuropeptidien dalarginin tai galaniinin kanssa Hargreavesin tulehduksellisessa kipumallissa oli jopa 60-kertainen verrattuna monomeerisiin FC5-neuropeptidikonjugaatteihin. Tämä tulos johtui FC5Fc- FC5-neuropeptidikonjugaattien pitkästä puoliintumisajasta verenkierrossa (~ 96 h) verrattuna FC5-neuropeptidikonjugaatteihin. (4) Erilaisilla kontrolloiduilla VHH-Fc-neuropeptidikonjugaateilla ei ollut systeemistä tehoa. (5) FC5:n fuusioiminen Fc:n C-terminaaliin johti heikentyneeseen BBB:n läpäisykykyyn. Toisin kuin TfR-kohdennetut BBB-kantajavasta-aineet, sekä mono- että bivalentit FC5Fc-fuusioproteiinit osoittivat samankaltaista transsytoosinopeutta in vitro, samankaltaisia plasman/CSF:n farmakokineettisiä profiileja ja samankaltaista systeemistä tehoa farmakodynamiikkamallissa in vivo huolimatta eroista näennäisessä sitoutumisaffiniteetissa ja -valenssissa (Farrington ym., 2014). Nämä tutkimukset osoittivat, että BBB:n läpäisevää yhden domeenin vasta-ainetta FC5 voidaan käyttää alustana BBB-kantajana sekä heterodimeerisinä ”puolivasta-aineina” että helpommin skaalautuvana kaksi- tai tetravalenttisena fuusiona tavanomaisiin IgG:hin (Farrington et al., 2014).

VHH:iden toinen potentiaalinen etu BBB-kantajina on niiden luontainen vastustuskyky äärimmäisille biofysikaalisille haasteille, kuten lämpötilalle ja pH:lle, sekä proteaasien hajoamiselle (Kim ym., 2014), joita esiintyy usein eri endosyyttisissä kompartimenteissa transsytoosin aikana. Sekä FC5- että FC5Fc-fuusiot internalisoituvat BEC:hen klatriinilla päällystettyjen vesikkelien kautta ja lajittuvat varhaisiin endosomeihin. Mielenkiintoista on, että FC5:n havaittiin myös stimuloivan solunulkoisten mikrovesikkelien (eksosomien) irtoamista BEC:stä (Haqqani, Caram-Salas, et al., 2013; Haqqani, Delaney, et al., 2013), jossa sekä FC5:n että sen oletetun reseptorin Cdc50A:n lisääntyneet tasot havaittiin Western blotilla ja kohdennetulla massaspektrometrillä. Tämä tutkimus viittasi siihen, että irronneet eksosomit voivat olla reseptori-vasta-ainekompleksia kuljettavan reseptori-vasta-ainekompleksin mukanaan tuova abluminaalipinnalta vapautuva RMT-reitin viimeinen vesikkeli (kaavamaisesti esitetty kuvassa 4). RMT-reitillä ja eksosomien muodostumisella on joitakin huomattavia yhtäläisyyksiä. Kuten eksosomien ensimmäisessä löydössä esitettiin, anti-TfR-vasta-ainetta seurattiin elektronimikroskopialla retikulosyyteissä (Théry, 2011) solujen pinnalta, klatriinilla päällystettyihin kuoppiin, varhaisten endosomien sisälle, multivesikulaaristen endosomien sisäisten vesikkelien pinnalle ja lopulta vapautuneisiin eksosomeihin sen jälkeen, kun multivesikulaariset endosomit olivat fuusioituneet plasmamembraanin kanssa (kuva 4). RMT näyttää purkautuvan samalla tavalla, ja BEC:n solunulkoisten mikrovesikkelien on osoitettu sisältävän useita reseptoreita, joiden tiedetään kuljettavan makromolekyylejä BBB:n läpi RMT:n kautta, mukaan lukien TfR, LRP, LDLR ja IR (Haqqani, Delaney ym., 2013).

Kuvatuista tutkimuksista pitäisi olla selvää, että keskushermostoon kohdistuvien bsAb:iden BBB-kuljetinvarsi vaatii huolellista optimointia kunkin RMT-reseptorin osalta. Tärkeitä näkökohtia CNS:ään kohdistuvien bsAb:ien suunnittelussa käsitellään jäljempänä ottaen huomioon TfR-BACE1 bsAb:n kehittämisestä ja omasta työstämme FC5:n kanssa BBB-kantajavasta-aineena saadut ”opetukset”.

Leave a Reply

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.