Hiiren primaaristen myoblastien puhdistus, karakterisointi ja siirto soluvälitteistä geeniterapiaa varten

Viljeltyjen myoblastien siirto kypsiin luurankolihaksiin on perusta uudelle terapeuttiselle lähestymistavalle lihassairauksiin ja muihin sairauksiin, jotka eivät ole lihassairauksia, nimittäin myoblastien geeniterapiaan. Myoblastisiirron onnistuminen lihaksen sisäisten vikojen korjaamiseksi riippuu istutettujen solujen fuusioitumisesta isännän myofibereihin. Aiemmat hiirillä tehdyt tutkimukset ovat olleet ongelmallisia, koska niissä on siirretty vakiintuneita myogeenisiä solulinjoja tai primaarisia lihasviljelmiä. Molemmilla solupopulaatioilla on haittapuolensa: myogeeniset solulinjat ovat tumorigeenisiä, ja primaariviljelmät sisältävät huomattavan suuren prosenttiosuuden ei-myogeenisiä soluja, jotka eivät fuusioidu isännän kuituihin. Lisäksi molempien solupopulaatioiden kohdalla isännän immuunisuppressio on ollut välttämätöntä, jotta siirretyt solut säilyisivät pitkällä aikavälillä. Näiden vaikeuksien voittamiseksi kehitimme uudet viljelyolosuhteet, jotka mahdollistavat hiiren myoblastien puhdistamisen primaariviljelmistä. Sekä primaaristen myoblastien rikastettuja että kloonipopulaatioita karakterisoitiin solujen proliferaatio- ja erilaistumismäärityksillä. Primaariset myoblastit olivat riippuvaisia lisätystä bFGF:stä kasvun varmistamiseksi ja säilyttivät kykynsä erilaistua jopa 30 populaatiokaksinkertaistumisen jälkeen. Puhtaiden myoblastipopulaatioiden kohtaloa siirron jälkeen seurattiin merkitsemällä solut merkkiaine-entsyymillä beetagalaktosidaasilla (beeta-gal) käyttämällä retrovirusvälitteistä geeninsiirtoa. Viiden päivän kuluessa siirrosta sukukypsien hiirten lihakseen primaariset myoblastit olivat fuusioituneet isännän lihassolujen kanssa muodostaen hybridi-myofibroja. Tutkiaksemme primaaristen myoblastien immunobiologiaa vertasimme siirrettyjä soluja syngeenisissä ja allogeenisissa isännissä. Jopa ilman immuunisuppressiota hybridikuidut säilyivät ja niiden beta-gal-ekspressio jatkui jopa kuusi kuukautta myoblastisiirron jälkeen syngeenisissä isännissä. Allogeenisissä isännissä istutetut solut hävisivät kokonaan kolmessa viikossa. Tumorigeenisuuden arvioimiseksi primäärisiä myoblasteja ja C2-myogeenisen solulinjan myoblasteja siirrettiin immuunipuutteisiin hiiriin. Vain C2-myoblastit muodostivat kasvaimia. Hiiren primaaristen myoblastien helppo eristäminen, kasvattaminen ja transfektointi tässä kuvatuissa olosuhteissa laajentavat mahdollisuuksia tutkia lihassolujen kasvua ja erilaistumista käyttämällä sekä normaaleista että mutanttihiirikannoista peräisin olevia myoblasteja. Näiden solujen ominaisuudet siirron jälkeen – syntyneiden hybridimyofibereiden vakaus ilman immuunisuppressiota, siirtogeenin ilmentymisen pysyvyys ja kasvainten puuttuminen – viittaavat siihen, että soluvälitteisen geeniterapian tutkimuksia, joissa käytetään primaarisia myoblasteja, voidaan nyt soveltaa laajalti hiirimalleihin, jotka kuvaavat ihmisen lihassairauksia ja muita kuin lihassairauksia.

Leave a Reply

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.