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Gensymbol: RNASE1

1. Allgemein

Die pankreatische Ribonuklease, auch bekannt als Ribonuklease A (RNase A) oder Ribonuklease 1 (RNase1), ist ein Enzym, das den Abbau von RNA katalysiert und eine Rolle bei der Verdauung von RNA in Wirbeltieren spielt. Frühe Arbeiten konzentrierten sich auf Rinderpankreas-RNase, da diese in der Bauchspeicheldrüse in großen Mengen vorhanden ist. Es wurde als das am besten untersuchte Enzym des 20. Jahrhunderts bezeichnet, und vier Nobelpreise wurden für die Erforschung dieses Proteins verliehen (20). Aufgrund der hohen Konzentrationen in der Rinderbauchspeicheldrüse wurde RNase1 in der Vergangenheit als Verdauungsenzym betrachtet, das jedoch beim Menschen und anderen Säugetieren, die keine Wiederkäuer sind, kaum Verwendung findet (2), da es dort in viel geringeren Konzentrationen vorkommt. Die Verdauung von RNA findet jedoch im Darm aller Spezies statt, und es ist inzwischen bekannt, dass RNase1 und andere Mitglieder ihrer Superfamilie zusätzliche Funktionen bei der Wirtsabwehr haben, auf die später eingegangen wird.

Struktur und Wirkmechanismus

Rinder-RNase1 wurde 1939 von Kunitz gereinigt und kristallisiert (16) und 1963 von Smyth, Stein und Moore sequenziert (30). Sie enthält 124 Aminosäuren, ein berechnetes Molekulargewicht von 13.683 und einen Überschuss an basischen Resten, was zu einem isoelektrischen Punkt von 8,5 – 9,0 führt. Es enthält vier Disulfidbindungen und wurde als Modell für die Untersuchung der Proteinfaltung verwendet (22). Sie ist außerdem an Asparaginresten glykosyliert, wobei die glykosylierte Form ursprünglich als RNase B bezeichnet wurde. Aufgrund der Glykosylierung und der Tertiärstruktur liegt sie auf den meisten SDS-Gelen bei 18 oder 19 kDa. Die RNase 1 vom Schwein enthält 125 Aminosäuren (26); die menschliche RNase 1 enthält 3 zusätzliche Aminosäuren am Carboxyl-Terminal als die bovine RNase1 (4). Die bovine RNase1 war das erste Enzym, dessen dreidimensionale Struktur bestimmt wurde. Es hat die Form einer Kidneybohne, wobei die aktive Stelle im Spalt His12, His119 und Lys41 enthält (25). Andere nicht katalytische Bindungsstellen helfen dem Enzym, einen Komplex mit seinem polymeren Substrat zu bilden. RNase1 katalysiert die Hydrolyse von 3′,5′-Phosphodiesterbindungen in einzelsträngiger RNA, wenn die Base auf der 3′-Seite ein Pyrimidin ist (7, 11, 23). Der Prozess wird gewöhnlich als zweistufig dargestellt, wobei der erste Schritt die Bildung eines zyklischen Phosphodiesters und der zweite seine Hydrolyse umfasst (23). RNase 1 hydrolysiert keine DNA, da ihr eine 2′-OH-Gruppe fehlt. Dadurch kann sie zur Entfernung von RNA-Kontaminationen aus der DNA eingesetzt werden. Sie wird auch in Ribonuklease-Schutz-Assays verwendet. RNase 1 bildet Dimere, indem sie die Aminotermini durch die Bildung von Sulfhydrylbindungen so austauscht, dass jede aktive Stelle aktiv bleibt (18). Unter Beibehaltung der hydrolytischen Funktion erhalten die Dimere eine zusätzliche biologische Aktivität, wobei Dimere, Trimere und Tetramere eine Antitumoraktivität besitzen

Ribonuclease A Superfamily

Das menschliche Genom kodiert für 122 verschiedene Ribonukleasen. Die RNAse A-Superfamilie besteht aus acht „kanonischen“ Ribonukleasen mit enzymatischer Aktivität und struktureller Homologie zur RNase A (15). Alle sind sekretorische Proteine, die eine disulfidgebundene Tertiärstruktur aufweisen und in der Lage sind, RNA abzubauen. Alle werden sowohl bei Menschen als auch bei Mäusen in einer engen Region von Chromosom 14 kodiert (27) und sind vermutlich durch Genduplikation entstanden (3, 31). Obwohl das Gen mehrere Exons enthält, wird die kodierende Region von einem einzigen Exon beigesteuert. Das Verständnis ihrer physiologischen Rolle ist unvollständig, aber die meisten sind wichtig für die Wirtsabwehr und die Angiogenese sowie die Verdauung (9). Das erste beschriebene Mitglied ist die RNase 1, die nicht nur ein Enzym der Bauchspeicheldrüse ist, sondern auch in einer Vielzahl von Zellen, einschließlich vaskulärer Endothelzellen, produziert wird, wo sie nach der Sekretion vaskuläre polymere RNA abbaut und eine Anti-HIV-1-Aktivität aufweist (15). RNase 2 und 3 sind sekretorische Proteine von Eosinophilen, die als Eosinophil Derived Neurotoxin (EDN) bzw. Eosinophil Cationic Protein (ECP) bezeichnet werden (15). RNase 4 kommt in zahlreichen Geweben vor, ihre physiologische Rolle ist jedoch unklar. RNase 5, auch als Angiogenin bekannt, fördert das Wachstum von Blutgefäßen (10). RNase 7 ist die am häufigsten vorkommende RNase in der Haut, während RNase 8 in der Plazenta vorkommt (15). Weitere Gene des Clusters sind mit Ribonukleasen verwandt (RNase 9 bis 13), aber ihre Proteine weisen Mutationen auf, die eine RNase-Aktivität verhindern. Einige der sekretierten RNasen oder ihre Oligomere können in Zellen eindringen und zytotoxische Wirkungen insbesondere auf Tumorzellen ausüben.

Ribonuklease-Inhibitor

Der Ribonuklease-Inhibitor (RI) der Säugetiere ist ein zytosolisches Protein von 50 KDa, das mit hoher Affinität und einer Stöchiometrie von 1:1 an die Pankreas-Ribonuklease bindet und sie dadurch inaktiviert (8, 17). Es ist besonders reichlich in Plazenta und Leber vorhanden und wurde zur Reinigung von RNase verwendet. Es hemmt alle Mitglieder der RNase-A-Familie. Seine dreidimensionale Struktur ist die eines Hufeisens, das leucinreiche Wiederholungen enthält. Obwohl die biologische Rolle nicht klar ist, sollte sie jedes Mitglied der RNase A-Familie, das den sekretorischen Weg verlässt und in das Zytoplasma gelangt, binden und inaktivieren.

2. Rolle der Ribonuklease in der Bauchspeicheldrüse

Die meisten Zellen enthalten millimolare Konzentrationen von Ribonukleotiden, aber nur mikromolare Konzentrationen von Desoxyribonukleotiden (5). Die Nahrung enthält also eine Mischung aus Ribonukleoprotein, RNA und Ribonukleotiden. Nukleoproteine werden durch Pankreasprotease abgebaut. Nach der Lehrbuchmeinung werden die Nukleinsäuren aus der Nahrung im Darm durch RNase und DNase der Bauchspeicheldrüse abgebaut. Eine neuere Studie hat jedoch gezeigt, dass Pepsin im Magen auch Nukleinsäuren hydrolysiert, so dass diese Verdauung dort beginnt (19). Zu den Lebensmitteln, die reich an Ribonukleoproteinen sind, gehören Organfleisch, Meeresfrüchte und Hülsenfrüchte (5).

Pankreatische RNase (RNase 1) ist in der Bauchspeicheldrüse aller Wirbeltiere vorhanden, aber die Menge variiert stark (2). Zu den Säugetieren mit großen Mengen gehören Huftiere, Nagetiere und pflanzenfressende Beuteltiere. Bei der Kuh macht RNase 20 % des Verdauungsenzyms aus; man nimmt an, dass dieser Bedarf auf die große RNA-Belastung zurückzuführen ist, die durch Bakterien bei der Pansenfermentation entsteht. Bei anderen Spezies, wie Menschen, Hunden, Katzen und niederen Wirbeltieren, ist die RNase in viel geringeren Mengen vorhanden und macht möglicherweise nur 0,5 bis 1 % der Pankreasenzyme aus. Obwohl es nur wenige Studien gibt, scheint die RNase der Bauchspeicheldrüse bei allen Spezies die mit der Nahrung aufgenommene Nukleinsäure im Darmlumen zu Nukleotiden aufzuspalten, die von der alkalischen Phosphatase und der 5′-Nukleotidase des Darms weiter zu Nukleosiden und freien Stickstoffbasen abgebaut werden. Die Verdauung von Nukleinsäuren hat also eine luminale und eine Bürstensaumphase. Diese Produkte werden von den Enterozyten absorbiert, aber die meisten werden mit dem Urin ausgeschieden; einige werden vor allem im nüchternen Zustand zur Resynthese verwendet (13, 21, 29). Normalerweise werden 80 bis 90 % der Nukleotide resorbiert, und diese können bei bestimmten Krankheiten oder in Zeiten eingeschränkter Aufnahme oder schnellen Wachstums unentbehrlich werden (5).

Ribonuklease wird in den Azinuszellen durch raues ER synthetisiert, gefaltet und in Zymogengranula verpackt, was bei der Ratte ab dem 20. Die Faltung erfolgt in den Zellen viel schneller als beim isolierten Protein, und mit Ausnahme einer geringen Menge an Dimeren wird jedes Protein, das nicht als gefaltetes Monomer endet, abgebaut (12). Es wird parallel zu anderen Verdauungsenzymen von Pankreasläppchen und -azini, die mit CCK oder cholinergen Analoga stimuliert werden, in das Medium sezerniert (14, 24, 28). Die Synthese von RNase 1 ist bei experimentellem Diabetes um 50 % reduziert, aber viel weniger als die Abnahme der Amylase.

3. Hilfsmittel für die Untersuchung von Ribonuclease1

a. Antikörper

Biocompare (www.biocompare.com) listet 394 Ribonuklease-Antikörper von 32 Anbietern auf. Einige sind speziesspezifisch, während andere spezifisch für RNase1 oder andere Familienmitglieder sind. Wir haben keinen dieser Antikörper getestet.

b. Ribonuklease-Aktivität

Frühe Ribonuklease-Assays verwendeten die Hydrolyse von Hefe-RNA; wir verwendeten einen von Anfinsen (1) beschriebenen Assay zur Messung der Sekretion von Pankreas-Ribonuklease durch isolierte Ratten-Pankreas-Acini (24). Diese Assays sind jedoch nicht spezifisch für RNase1 und eigneten sich für die Untersuchung der Sekretion von Pankreas-Azinuszellen, da RNase1 die Hauptform ist, die in Pankreas-Azini vorliegt. Es wurde auch ein Assay beschrieben, der die Hydrolyse von Cytidin-2′-3′-phosphat nutzt (6). Kürzlich wurde ein quantitativer Fluoreszenztest entwickelt, der auf der Bindung von Ethidiumbromid an Hefe-RNA basiert (32).

4. Referenzen

  1. Anfinsen CB, Redfield RR, Choate WL, Page J, and Carroll WR. Studien über die Grobstruktur, Querverbindungen und terminale Sequenzen in Ribonuklease. J Biol Chem 207: 201-210, 1954. PMID: 13152095
  2. Barnard EA. Biologische Funktion der Pankreas-Ribonuklease. Nature 221: 340-344, 1969. PMID: 4974403
  3. Beintema JJ, und Kleineidam RG. Die Ribonuklease A Superfamilie: allgemeine Diskussion. Cell Mol Life Sci 54: 825-832, 1998. PMID: 9760991
  4. Beintema JJ, Wietzes P, Weickmann JL, und Glitz DG. Die Aminosäuresequenz der menschlichen Pankreas-Ribonuklease. Anal Biochem 136: 48-64, 1984. PMID: 6201087
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