Nanobody

4.3 BBB-crossing bsAbs engineered with single-domain antibodies

sdAbs sind kleine (15 kDa), monomere Antigen-bindende Fragmente von Antikörpern, die als „Bausteine“ für bsAbs verschiedene Vorteile gegenüber anderen Antikörperfragmenten bieten. Sie kommen in der Natur als antigenbindender Teil von Antikörpern der schweren Kette bei Kameliden (genannt VHH) und Knorpelfischen (genannt VNAR) vor oder können aus herkömmlichen IgGs durch Gewinnung oder Entwicklung monomerer, stabiler VH- oder VL-Domänen erzeugt werden (Hamers-Casterman et al., 1993; Hussack et al., 2012; Kim et al, 2014; Nuttall, 2012; Ward, Güssow, Griffiths, Jones, & Winter, 1989). sdAbs sind hochstabil und kompakt und können Zugang zu vertieften Epitopen in Proteinen, wie Rezeptorhohlräumen oder aktiven Stellen von Enzymen, erhalten, die für herkömmliche IgGs oft „versteckt“ sind, und können Zielbindungsaffinitäten erreichen, die mit denen herkömmlicher Antikörper vergleichbar sind (Lauwereys et al., 1998; Staus et al., 2014). Diese monomeren Antigen-bindenden Einheiten paaren sich nicht mit leichten Ketten, was sie zu hervorragenden Bausteinen für heterodimerisierte bsAbs macht, da sie die Schwierigkeiten einer falschen Paarung der leichten Ketten vermeiden (Hamers-Casterman et al., 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). Heterodimere bsAbs können mit einem oder beiden „Armen“ als sdAb hergestellt werden, wobei letztere in ihrer Struktur den schwerkettigen Antikörpern der Kameliden ähneln (Abb. 3E). sdAbs können auch in verschiedenen mono-, bi- oder tetravalenten Fusionen mit herkömmlichen therapeutischen Antikörpern oder Fabs verwendet werden (Abb. 3E). 3E), was im Allgemeinen zu kleineren, weniger komplexen Molekülen führt, verglichen mit jenen, die mit scFvs oder Fabs als Bausteinen erzeugt werden, die sich biophysikalisch gut verhalten und leicht herzustellen sind (Holliger & Hudson, 2005). Die Humanisierung von VHHs sowie das Engineering von sdAbs ist gut beschrieben und ermöglicht die einfache Herstellung von human(isierten) sdAbs mit optimaler Zielaffinität und außergewöhnlichen biophysikalischen Eigenschaften (Vincke et al, 2009).

Um die potenzielle Verwendung des Kameliden VHH FC5 als BHS-Träger in bispezifischen ZNS-Antikörpern zu bewerten, wurden monovalente und bivalente Fusionen (N- und C-Terminus) von FC5 mit menschlichem Fc entwickelt und in vitro und in vivo untersucht (Farrington et al., 2014). Die scheinbare Bindungsaffinität (Kdapp) der bivalenten FC5Fc-Fusion an Ratten-BEC betrug 75 nM, während die monovalente FC5Fc-Bindung im mikromolaren Bereich lag. Die Analysen der scheinbaren Transmigrationsraten (Papp) durch ein in vitro BHS-Modell, der scheinbaren ZNS-Exposition, die aus der Serum-/CSF-Pharmakokinetik systemisch verabreichter Antikörperkonstrukte abgeleitet wurde, und der pharmakologischen Reaktionen, die durch chemisch konjugierte BHS-impermeable neuroaktive Peptide im Hargreaves-Schmerzmodell ausgelöst wurden, lieferten den Beweis für einen erhöhten BHS-Transport dieser großen (75 kDa) Antikörpermoleküle, der durch FC5 vermittelt wird: (1) Die in vitro Papp-Werte betrugen ~ 200 cm/min für mono- und bivalente N-terminale Fc-Fusionsmoleküle (FC5Fc) im Vergleich zu 4-8 cm/min für VHH A20.1Fc- oder EG2Fc-Fusionsmoleküle; (2) die scheinbare ZNS-Exposition der FC5Fc-Fusion war 30-mal höher als die der Kontrolldomänen-Antikörper-Fc-Fusionen; (3) die systemische pharmakologische Wirksamkeit von FC5Fc-Konjugaten mit den Neuropeptiden Dalargin oder Galanin im Hargreaves-Modell für entzündliche Schmerzen war bis zu 60-mal höher als die von monomeren FC5-Neuropeptid-Konjugaten. Dieses Ergebnis wurde auf die lange zirkulatorische Halbwertszeit (~ 96 h) von FC5Fc- im Vergleich zu FC5-Neuropeptid-Konjugaten zurückgeführt; (4) verschiedene Kontroll-VHH-Fc-Neuropeptid-Konjugate zeigten keine systemische Wirksamkeit; (5) die Fusion von FC5 mit dem C-Terminus von Fc führte zu einer abgeschwächten Fähigkeit, die BHS zu überwinden. Im Gegensatz zu TfR-Antikörpern, die auf den BHS-Träger abzielen, zeigten sowohl mono- als auch bivalente FC5Fc-Fusionsproteine eine ähnliche Transzytoserate in vitro, ähnliche pharmakokinetische Profile im Plasma/CSF und eine ähnliche systemische Wirksamkeit im pharmakodynamischen Modell in vivo, trotz Unterschieden in der offensichtlichen Bindungsaffinität und -valenz (Farrington et al., 2014). Diese Studien haben gezeigt, dass der BHS-überwindende Single-Domain-Antikörper FC5 als Plattform-BHS-Träger sowohl in Form von heterodimerisierten „Halb-Antikörpern“ als auch als leichter skalierbare bi- oder tetravalente Fusion mit herkömmlichen IgGs verwendet werden kann (Farrington et al, 2014).

Ein weiterer potenzieller Vorteil von VHHs als BHS-Träger ist ihre natürliche Resistenz gegenüber extremen biophysikalischen Herausforderungen wie Temperatur und pH-Wert sowie gegenüber dem Abbau durch Proteasen (Kim et al., 2014), die häufig in verschiedenen endozytischen Kompartimenten während der Transzytose auftreten. Sowohl FC5 als auch FC5Fc-Fusionen werden über Clathrin-beschichtete Vesikel in BEC internalisiert und zu frühen Endosomen sortiert. Interessanterweise wurde festgestellt, dass FC5 auch die Freisetzung von extrazellulären Mikrovesikeln (Exosomen) aus BEC stimuliert (Haqqani, Caram-Salas, et al., 2013; Haqqani, Delaney, et al., 2013), in denen sowohl FC5 als auch erhöhte Mengen seines mutmaßlichen Rezeptors Cdc50A durch Western Blot und gezielte Massenspektrometrie nachgewiesen wurden. Diese Studie deutet darauf hin, dass ausgeschiedene Exosomen das letzte Vesikel des RMT-Wegs sein könnten, das von der abluminalen Oberfläche freigesetzt wird und den Rezeptor-Antikörper-Komplex trägt (schematisch dargestellt in Abb. 4). Der RMT-Weg und die Bildung von Exosomen weisen einige bemerkenswerte Ähnlichkeiten auf. Wie in der ersten Entdeckung von Exosomen beschrieben, wurde ein Anti-TfR-Antikörper in Retikulozyten elektronenmikroskopisch verfolgt (Théry, 2011), und zwar von der Zelloberfläche, in mit Clathrin beschichteten Gruben, innerhalb früher Endosomen, auf der Oberfläche interner Vesikel multivesikulärer Endosomen und schließlich auf den freigesetzten Exosomen nach der Fusion der multivesikulären Endosomen mit der Plasmamembran (Abb. 4). Die RMT scheint sich in ähnlicher Weise zu entfalten, und es wurde gezeigt, dass die extrazellulären Mikrovesikel der BEC mehrere Rezeptoren enthalten, von denen bekannt ist, dass sie Makromoleküle über die BHS durch die RMT transportieren, darunter TfR, LRPs, LDLR und IR (Haqqani, Delaney, et al., 2013).

Aus den beschriebenen Studien sollte ersichtlich sein, dass der BHS-Trägerarm von ZNS-targeting bsAb für jeden RMT-Rezeptor sorgfältig optimiert werden muss. Wichtige Überlegungen bei der Entwicklung von auf das ZNS abzielenden bsAbs werden im Folgenden im Hinblick auf die „Lehren“ aus der Entwicklung von TfR-BACE1 bsAb und aus unserer eigenen Arbeit mit FC5 als BHS-Träger-Antikörper erörtert.

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