Pancreapedia

Gensymbol: RNASE1

1. Generelt

Pancreatisk ribonuklease, også kendt som ribonuklease A (RNase A) eller ribonuklease 1 (RNase1), er et enzym, der katalyserer nedbrydningen af RNA og spiller en rolle i fordøjelsen af RNA i hvirveldyrarter. Tidligt arbejde fokuserede på RNase fra bovin pankreas på grund af den store mængde RNase, der findes i bugspytkirtlen. Det er blevet beskrevet som det bedst undersøgte enzym i det 20. århundrede, og fire nobelpriser er blevet tildelt for undersøgelser af dette protein (20). På grund af de store mængder, der findes i bovin pancreas, blev RNase1 historisk set betragtet som et fordøjelsesenzym, men med ringe formål hos mennesker og andre pattedyr, der ikke er drøvtyggere (2), hvor det findes i meget lavere koncentrationer. Der sker imidlertid fordøjelse af RNA i tarmen hos alle arter, og RNase1 og andre medlemmer af dets superfamilie er nu kendt for at have yderligere funktioner i værtsforsvaret, som vil blive diskuteret senere.

Struktur og virkningsmekanisme

Bovin RNase1 blev oprenset og krystalliseret af Kunitz i 1939 (16) og sekventeret af Smyth, Stein og Moore i 1963 (30). Den indeholder 124 aminosyrer, en beregnet molekylvægt på 13 683 og et overskud af basiske rester, der fører til et isoelektrisk punkt på 8,5 – 9,0. Den indeholder fire disulfidbindinger og er blevet brugt som model til at studere proteinfoldning (22). Den er også glykosyleret på asparaginrester, og den glykosylerede form blev oprindeligt kaldt RNase B. På grund af glykosyleringen og den tertiære struktur løber den på de fleste SDS-geler ved 18 eller 19 kDa. RNase 1 fra svin indeholder 125 aminosyrer (26); RNase 1 fra mennesker indeholder 3 ekstra aminosyrer på carboxylterminalen i forhold til RNase 1 fra kvæg (4). Bovin RNase1 var det første enzym, hvis tredimensionelle struktur blev bestemt. Det har en samlet form som en kidneybønne med det aktive sted i kløften, der indeholder His12, His119 og Lys41 (25). Andre ikke-katalytiske bindingssteder hjælper enzymet til at danne et kompleks med dets polymere substrat. RNase1 katalyserer hydrolysen af 3′,5′-phosphodiesterbindinger i enkeltstrenget RNA, når basen på 3′-siden er et pyrimidin (7, 11, 23). Processen fremstilles normalt som værende i to trin, hvor det første trin omfatter dannelsen af en cyklisk phosphodiester og det andet trin hydrolyseres (23). RNase 1 hydrolyserer ikke DNA, da den ikke har en 2′-OH-gruppe. Dette gør det muligt at anvende det til at fjerne RNA-forurening fra DNA. Den anvendes også i ribonukleasebeskyttelsesassays. RNase 1 danner dimerer ved at ombytte domæner af aminoterminaler ved dannelse af sulfhydrylbindinger på en sådan måde, at hvert aktivt sted forbliver aktivt (18). Samtidig med at de bevarer den hydrolytiske funktion, får dimererne en yderligere biologisk aktivitet, idet dimere, trimere og tetramere har anti-tumoraktivitet

Ribonuklease A Superfamily

Det menneskelige genom koder for 122 separate ribonukleaser. RNAse A-superfamilien består af otte “kanoniske” ribonukleaser med enzymatisk aktivitet og strukturel homologi med RNase A (15). Alle er sekretoriske proteiner, der deler en disulfidbundet tertiær struktur og er i stand til at nedbryde RNA. Alle er kodet for i et snævert område af kromosom 14 hos både mennesker og mus (27) og menes at være opstået ved genduplikation (3, 31). Selv om genet indeholder flere exoner, bidrager en enkelt exon til den kodende region. Forståelsen af deres fysiologiske rolle er ufuldstændig, men de fleste er vigtige for værtsforsvaret og angiogenese samt for fordøjelsen (9). Det første medlem, der beskrives, er RNase 1, som ud over at være et pancreatisk enzym produceres i en række celler, herunder vaskulære endotelceller, hvor det efter sekretion nedbryder vaskulært polymer RNA og har anti-HIV-1-aktivitet (15). RNase 2 og 3 er eosinofile sekretoriske proteiner, der betegnes henholdsvis eosinofilt afledt neurotoksin (EDN) og eosinofilt kationisk protein (ECP) (15). RNase 4 er til stede i flere væv, men dets fysiologiske rolle er uklar. RNase 5, der også er kendt som angiogenin, inducerer vækst af blodkar (10). RNase 7 er den hyppigst forekommende RNase i huden, mens RNase 8 udtrykkes i placenta (15). Yderligere gener i klyngen er relateret til ribonukleaser (RNase 9 til 13), men deres proteiner har mutationer, der forhindrer RNaseaktivitet. Nogle af de sekreterede RNaser eller deres oligomerer kan trænge ind i celler og udøve cytotoksiske virkninger især på tumorceller.

Ribonukleaseinhibitor

Mammalian ribonukleaseinhibitor (RI) er et cytosolisk protein på 50 KDa, der binder med høj affinitet og 1:1-støkiometri til pancreatisk ribonuklease og derved inaktiverer den (8, 17). Det er særligt hyppigt forekommende i placenta og lever og er blevet anvendt til at rense RNase. Det hæmmer alle medlemmer af RNase A-familien. Dens tredimensionelle struktur er som en hestesko, der indeholder leucinrige gentagelser. Selv om den biologiske rolle ikke er klarlagt, bør den binde og inaktivere ethvert medlem af RNase A-familien, der undslipper den sekretoriske vej og kommer ind i cytoplasmaet.

2. Ribonukleasens rolle i bugspytkirtlen

De fleste celler indeholder millimolære koncentrationer af ribonukleotider, men kun mikromolære koncentrationer af desoxyribonukleotider (5). Kosten indeholder således en blanding af ribonucleoprotein, RNA og ribonucleotider. Nukleoproteinerne nedbrydes af protease fra bugspytkirtlen. Ifølge lærebogen nedbrydes nukleinsyrer fra kosten af RNase og DNase fra bugspytkirtlen i tarmen. En nyere undersøgelse har imidlertid vist, at pepsin i maven også hydrolyserer nukleinsyre, så denne fordøjelse starter der (19). Fødevarer, der er rige på ribonukleoproteiner, omfatter organkød, fisk og skaldyr og bælgfrugter (5).

Pancreas RNase (RNase 1) findes i alle hvirveldyrs bugspytkirtler, men mængden varierer meget (2). Pattedyr med store mængder omfatter hovdyr, gnavere og planteædende pungdyr. Hos koen udgør RNase 20 % af fordøjelsesenzymet; dette krav menes at skyldes den store RNA-belastning, der produceres af bakterier fra ruminal fermentering. Hos andre arter, herunder mennesker, hunde, katte og lavere hvirveldyr, er RNase til stede i meget lavere mængder og udgør måske kun 0,5 til 1 % af pancreasenzymerne. Selv om der kun foreligger få undersøgelser, synes pancreatisk RNase hos alle arter at nedbryde diætnukleinsyre i tarmlumen til nukleotider, som yderligere nedbrydes af intestinal alkalisk fosfatase og 5′-nukleotidase til nukleosider og frie nitrogenholdige baser. Fordøjelsen af nukleinsyrer har derfor en luminal fase og en fase ved børstensgrænsen. Disse produkter absorberes af enterocytter, men de fleste udskilles i urinen; nogle anvendes til resyntese primært i fastende tilstand (13, 21, 29). Normalt absorberes 80-90 % af nukleotiderne, og disse kan blive essentielle ved visse sygdomme eller i perioder med begrænset indtagelse eller hurtig vækst (5).

Ribonuklease syntetiseres i acinærceller af ru ER, foldes og pakkes i zymogengranula, der begynder ved 20 dages drægtighed hos rotte (33). Foldning sker meget hurtigere i cellerne sammenlignet med det isolerede protein, og bortset fra en lille mængde dimer nedbrydes ethvert protein, der ikke ender som en foldet monomer, (12). Det udskilles i mediet parallelt med andre fordøjelsesenzymer af pancreatiske lobuli og acini stimuleret med CCK eller cholinergiske analoger (14, 24, 28). RNase 1-syntesen er reduceret ved eksperimentel diabetes med 50 %, men langt mindre end faldet for amylase.

3. Værktøjer til undersøgelse af Ribonuklease1

a. Antistoffer

Biocompare (www.biocompare.com) indeholder en liste over 394 ribonuklease-antistoffer fra 32 leverandører. Nogle er artsspecifikke, mens andre er specifikke for RNase1 eller andre familiemedlemmer. Vi har ikke testet nogen af disse antistoffer.

b. Ribonukleaseaktivitet

De tidlige ribonukleaseassays anvendte hydrolyse af gær-RNA; vi anvendte et assay beskrevet af Anfinsen (1) til at måle sekretionen af pancreatisk ribonuklease fra isolerede pancreatiske acini fra rottepancreasacini (24). Disse analyser er imidlertid ikke specifikke for RNase1 og fungerede til undersøgelse af sekretion af pancreasacinarer, fordi RNase1 er den vigtigste form, der findes i pancreasacini. Der er også beskrevet et forsøg med hydrolyse af cytidin 2′-3′-phosphat (6). For nylig blev der udviklet et kvantitativt fluorescensassay baseret på binding af ethidiumbromid til gær-RNA (32).

4. Referencer

  1. Anfinsen CB, Redfield RR, Choate WL, Page J, og Carroll WR. Undersøgelser af bruttostruktur, krydsforbindelser og terminale sekvenser i ribonuklease. J Biol Chem 207: 201-210, 1954. PMID: 13152095
  2. Barnard EA. Biologisk funktion af ribonuklease fra bugspytkirtlen. Nature 221: 340-344, 1969. PMID: 4974403
  3. Beintema JJ, og Kleineidam RG. Superfamilien af ribonuklease A: generel diskussion. Cell Mol Life Sci 54: 825-832, 1998. PMID: 9760991
  4. Beintema JJ, Wietzes P, Weickmann JL, og Glitz DG. Aminosyresekvensen af human pancreatisk ribonuklease. Anal Biochem 136: 48-64, 1984. PMID: 6201087
  5. Carver JD, og Walker, WA. Nukleotidernes rolle i den menneskelige ernæring. J Nutr Biochem 6: 58 – 72, 1995.
  6. Crook EM, Mathias AP, og Rabin BR. Spektrofotometrisk bestemmelse af bovin pancreatisk ribonuklease ved anvendelse af cytidin 2′:3′-phosphat. Biochem J 74: 234-238, 1960. PMID: 13812977
  7. Cuchillo CM, Nogues MV, og Raines RT. Bovin pancreatisk ribonuklease: halvtreds år med den første enzymatiske reaktionsmekanisme. Biochemistry 50: 7835-7841, 2011. PMID: 21838247
  8. Dickson KA, Haigis MC, og Raines RT. Ribonukleaseinhibitor: struktur og funktion. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 80: 349-374, 2005. PMID: 16164979
  9. Dyer KD, og Rosenberg HF. RNase a-superfamilien: generering af diversitet og medfødt værtsforsvar. Mol Divers 10: 585-597, 2006. PMID: 16969722
  10. Fett JW, Strydom DJ, Lobb RR, Alderman EM, Bethune JL, Riordan JF, og Vallee BL. Isolering og karakterisering af angiogenin, et angiogenisk protein fra humane karcinomceller. Biochemistry 24: 5480-5486, 1985. PMID: 4074709
  11. Findlay D, Herries DG, Mathias AP, Rabin BR, og Ross CA. Det aktive sted og virkningsmekanismen for bovin pancreatisk ribonuklease. Nature 190: 781-784, 1961. PMID: 13699542
  12. Geiger R, Gautschi M, Thor F, Hayer A og Helenius A. Foldning, kvalitetskontrol og sekretion af pancreatisk ribonuklease i levende celler. J Biol Chem 286: 5813-5822, 2011. PMID: 21156800
  13. Ho CY, Miller KV, Savaiano DA, Crane RT, Ericson KA, og Clifford AJ. Optagelse og metabolisme af oralt indgivne puriner hos fodrede og fastende rotter. J Nutr 109: 1377-1382, 1979. PMID: 458492
  14. Iwanij V, og Jamieson JD. Biokemisk analyse af sekretoriske proteiner syntetiseret af normal rottepancreas og af pancreatiske acinartumorceller. J Cell Biol 95: 734-741, 1982. PMID: 6185502
  15. Koczera P, Martin L, Marx G og Schuerholz T. The Ribonuclease A Superfamily in Humans: Kanoniske RNaser som støtte for den medfødte immunitet. Int J Mol Sci 17: 2016. PMID: 27527162
  16. Kunitz M. Krystallinsk ribonuklease. J Gen Physiol 24: 15-32, 1940. PMID: 19873197
  17. Lee FS, og Vallee BL. Struktur og virkning af pattedyrs ribonuklease (angiogenin) inhibitor. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 44: 1-30, 1993. PMID: 8434120
  18. Libonati M. Biological actions of the oligomers of ribonuclease A. Cell Mol Life Sci 61: 2431-2436, 2004. PMID: 15526151
  19. Liu Y, Zhang Y, Dong P, An R, Xue C, Ge Y, Wei L og Liang X. Fordøjelsen af nukleinsyrer begynder i maven. Sci Rep 5: 11936, 2015. PMID: 26168909
  20. Marshall GR, Feng JA, og Kuster DJ. Back to the future: ribonuclease A. Biopolymers 90: 259-277, 2008. PMID: 17868092
  21. McAllan AB. Nedbrydning af nukleinsyrer i og fjernelse af nedbrydningsprodukter fra tyndtarmen hos stude. Br J Nutr 44: 99-112, 1980. PMID: 6158999
  22. Moore S, og Stein WH. Kemiske strukturer af pancreatisk ribonuklease og deoxyribonuklease. Science 180: 458-464, 1973. PMID: 4573392
  23. Nogues MV, Vilanova M, og Cuchillo CM. Bovin pancreatisk ribonuklease A som en model for et enzym med flere substratbindingssteder. Biochim Biophys Acta 1253: 16-24, 1995. PMID: 7492594
  24. Otsuki M, og Williams JA. Virkning af diabetes mellitus på reguleringen af enzymsekretion fra isolerede pancreatiske acini fra rotte. J Clin Invest 70: 148-156, 1982. PMID: 6177717
  25. Raines RT. Ribonuklease A. Chem Rev 98: 1045-1066, 1998.
  26. Reinhold VN, Dunne FT, Wriston JC, Schwarz M, Sarda L og Hirs CH. Isolering af ribonuklease fra svin, et glykoprotein, fra bugspytkirtelsaft. J Biol Chem 243: 6482-6494, 1968. PMID: 5715511
  27. Samuelson LC, Wiebauer K, Howard G, Schmid RM, Koeplin D, og Meisler MH. Isolering af det murine ribonuklease-gen Rib-1: struktur og vævsspecifik ekspression i bugspytkirtel og parotidkirtel. Nucleic Acids Res 19: 6935-6941, 1991. PMID: 1840677
  28. Scheele GA, og Palade GE. Undersøgelser af pancreas hos marsvin. Parallel udledning af exokrine enzymaktiviteter. J Biol Chem 250: 2660-2670, 1975. PMID: 1123325
  29. Schwenk M, Hegazy E, og Lopez del Pino V. Uridinoptagelse af isolerede tarmepithelceller fra marsvin. Biochim Biophys Acta 805: 370-374, 1984. PMID: 6210111
  30. Smyth DG, Stein WH og Moore S. The sequence of amino acid residues in bovine pancreatic ribonuclease: revised and confirmations. J Biol Chem 238: 227-234, 1963. PMID: 13989651
  31. Sorrentino S. De otte humane “kanoniske” ribonukleaser: molekylær diversitet, katalytiske egenskaber og særlige biologiske virkninger af enzymproteinerne. FEBS Lett 584: 2194-2200, 2010. PMID: 20388512
  32. Tripathy DR, Dinda AK og Dasgupta S. A simple assay for ribonukleaseaktivitet af ribonukleaser i tilstedeværelse af ethidiumbromid. Anal Biochem 437: 126-129, 2013. PMID: 23499964
  33. Van Nest GA, MacDonald RJ, Raman RK, og Rutter WJ. Proteiner, der syntetiseres og sekreteres under udvikling af rottepancreas. J Cell Biol 86: 784-794, 1980. PMID: 7410479

Leave a Reply

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.