Nanobody

4.3 BBB-krydsende bsAbs konstrueret med enkeltdomæne-antistoffer

sdAbs er små (15 kDa), monomere antigenbindende fragmenter af antistoffer, som giver forskellige fordele i forhold til andre antistoffragmenter som “byggesten” til bsAbs. De forekommer i naturen som den antigenbindende del af tunge kædeantistoffer hos kamelide arter (kaldet VHH) og bruskfisk (kaldet VNAR) eller kan genereres fra konventionelle IgG’er ved at opnå eller konstruere monomere, stabile VH- eller VL-domæner (Hamers-Casterman et al., 1993; Hussack et al., 2012; Kim et al., 2014; Nuttall, 2012; Ward, Güssow, Griffiths, Jones, & Winter, 1989). sdAbs er meget stabile og kompakte, og de kan få adgang til forsænkede epitoper i proteiner, såsom receptorhulrum eller enzymernes aktive steder, som ofte er “skjult” for konventionelle IgG’er, og de kan opnå målbindingsaffiniteter, der er sammenlignelige med konventionelle antistoffers (Lauwereys et al., 1998; Staus et al., 2014). Disse monomere antigenbindende enheder danner ikke par med lyskæder, hvilket gør dem til fremragende byggesten til heterodimeriserede bsAbs, da de undgår vanskeligheder ved ukorrekt parring af lyskæder (Hamers-Casterman et al., 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). Heterodimere bsAbs kan skabes med en eller begge “arme” bestående af sdAb, idet sidstnævnte har samme struktur som kamelidernes tungkædede antistoffer (fig. 3E). sdAbs kan også anvendes i forskellige mono-, bi- eller tetravalente fusioner med konventionelle terapeutiske antistoffer eller Fabs (fig. 3E). 3E), hvilket generelt resulterer i mindre, mindre komplekse molekyler sammenlignet med dem, der genereres med scFvs eller Fabs som byggeklodser, som har tendens til at være biofysisk velfungerende og lette at producere (Holliger & Hudson, 2005). Humanisering af VHHs samt engineering af sdAbs er velbeskrevet, hvilket gør det muligt let at generere human(ized) sdAbs med optimal målaffinitet og exceptionelle biofysiske egenskaber (Vincke et al, 2009).

For at evaluere den potentielle brug af camelid VHHH FC5 som en BBB-bærer i bispecifikke CNS-målrettede antistoffer blev monovalente og bivalente fusioner (N- og C-terminus) af FC5 med humant Fc designet og evalueret in vitro og in vivo (Farrington et al., 2014). Den tilsyneladende bindingsaffinitet (Kdapp) til rotte-BEC af den bivalente FC5Fc-fusion var 75 nM, mens monovalent FC5Fc-binding var i det mikromolære område. Analyserne af tilsyneladende transmigrationshastigheder (Papp) gennem en in vitro BBB-model, tilsyneladende CNS eksponering afledt af serum/CSF farmakokinetik af systemisk administrerede antistofkonstruktioner og farmakologiske responser fremkaldt af kemisk konjugerede BBB-impermeable neuroaktive peptider i Hargreaves smerte model, gav beviser for øget BBB-transport af disse store (75 kDa) antistofmolekyler formidlet af FC5: (1) in vitro Papp-værdierne var ~ 200 cm/min for både mono- og bivalente N-terminale N-terminale Fc-fusionsmolekyler (FC5Fc) sammenlignet med 4-8 cm/min for kontrol-VHHH A20.1Fc- eller EG2Fc-fusioner; (2) den tilsyneladende CNS-eksponering af FC5Fc-fusionen var 30 gange højere sammenlignet med kontroldomæne-antistof-Fc-fusioner; (3) den systemiske farmakologiske potens af FC5Fc-konjugater med neuropeptiderne dalargin eller galanin i Hargreaves inflammatoriske smertemodel var op til 60 gange højere sammenlignet med monomere FC5-neuropeptidkonjugater. Dette resultat blev tilskrevet den lange cirkulatoriske halveringstid (~ 96 timer) for FC5Fc- sammenlignet med FC5-neuropeptidkonjugater; (4) forskellige kontrol-VHHH-Fc-neuropeptidkonjugater viste ingen systemisk effekt; (5) fusion af FC5 til Fc’s C-terminus resulterede i en svækket BBB-krydsningskapacitet. I modsætning til TfR-målrettede BBB-bærende antistoffer viste både mono- og bivalente FC5Fc-fusionsproteiner en lignende transcytosehastighed in vitro, lignende plasma/CSF-farmakokinetiske profiler og lignende systemisk potens i den farmakodynamiske model in vivo, på trods af forskelle i tilsyneladende bindingsaffinitet og valens (Farrington et al., 2014). Disse undersøgelser viste, at det BBB-krydsende enkeltdomæne-antistof FC5 kan anvendes som en platform BBB-bærer i både heterodimeriserede “halv-antistoffer” og som den mere let skalerbare bi- eller tetravalente fusion til konventionelle IgG’er (Farrington et al, 2014).

En anden potentiel fordel ved VHHH’er som BBB-bærere er deres naturlige modstandsdygtighed over for ekstreme biofysiske udfordringer, såsom temperatur og pH, samt over for protease-nedbrydning (Kim et al., 2014), der ofte forekommer i forskellige endocytiske kompartmenter under transcytose. Både FC5- og FC5Fc-fusioner internaliseres i BEC via clathrincoatede vesikler og sorteres til tidlige endosomer. Interessant nok blev det også konstateret, at FC5 stimulerer udskillelse af ekstracellulære mikrovesikler (exosomer) fra BEC (Haqqani, Caram-Salas, et al., 2013; Haqqani, Delaney, et al., 2013), hvor både FC5 og øgede niveauer af dets formodede receptor Cdc50A blev påvist ved Western blot og målrettet massespektrometri. Denne undersøgelse foreslog, at udskillede exosomer kan være den sidste vesikel i RMT-vejen, der frigives fra den abluminale overflade, som bærer receptor-antistofkomplekset (skematisk vist i fig. 4). RMT-vejen og exosomdannelsen har nogle bemærkelsesværdige ligheder. Som skitseret i den første opdagelse af exosomer blev et anti-TfR-antistof sporet ved hjælp af elektronmikroskopi i reticulocytter (Théry, 2011) fra cellens overflade, ind i clathrinbelagte huller, inde i tidlige endosomer, på overfladen af interne vesikler i multivesikulære endosomer og endelig på de frigivne exosomer efter fusion af de multivesikulære endosomer med plasmamembranen (Fig. 4). RMT synes at udfolde sig på en lignende måde, og de ekstracellulære mikrovesikler fra BEC har vist sig at indeholde flere receptorer, der er kendt for at transportere makromolekyler over BBB via RMT, herunder TfR, LRPs, LDLR og IR (Haqqani, Delaney, et al., 2013).

Fra de beskrevne undersøgelser bør det være indlysende, at BBB-bærerarmen af bsAb med CNS-målretning kræver omhyggelig optimering for hver enkelt RMT-receptor. Vigtige overvejelser i forbindelse med udformning af CNS-målrettede bsAbs diskuteres nedenfor i lyset af “erfaringer” fra udviklingen af TfR-BACE1 bsAb og fra vores eget arbejde med FC5 som et BBB-bærende antistof.

Leave a Reply

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.