Pancreapedia

Genový symbol: RNASE1

1. Obecně

Pankreatická ribonukleáza známá také jako ribonukleáza A (RNáza A) nebo ribonukleáza 1 (RNáza1) je enzym, který katalyzuje rozklad RNA a hraje roli při trávení RNA u obratlovců. První práce se zaměřily na hovězí pankreatickou RNasu, protože je jí ve slinivce přítomno velké množství. Je označována za nejlépe prozkoumaný enzym 20. století, přičemž za studium tohoto proteinu byly uděleny čtyři Nobelovy ceny (20). Vzhledem k vysokému množství přítomnému v hovězí slinivce břišní byla RNáza1 historicky považována za trávicí enzym, ale s malým významem u lidí a jiných nepřežvýkavých savců (2), kde se vyskytuje v mnohem nižších koncentracích. Ke štěpení RNA však dochází ve střevě všech druhů a nyní je známo, že RNáza1 a další členové její nadrodiny mají další funkce v obraně hostitele, o kterých bude pojednáno později.

Struktura a mechanismus účinku

Hovězí RNáza1 byla purifikována a krystalizována Kunitzem v roce 1939 (16) a sekvenována Smythem, Steinem a Moorem v roce 1963 (30). Obsahuje 124 aminokyselin, vypočtenou molekulovou hmotnost 13 683 a přebytek bazických zbytků, což vede k izoelektrickému bodu 8,5 – 9,0. V této skupině se vyskytují i další aminokyseliny. Obsahuje čtyři disulfidové vazby a byl použit jako model pro studium skládání proteinů (22). Je také glykosylovaná na asparaginových zbytcích, přičemž glykosylovaná forma byla původně označována jako RNasa B. Kvůli glykosylaci a terciární struktuře probíhá na většině SDS gelů při 18 nebo 19 kDa. Prasečí RNasa 1 obsahuje 125 aminokyselin (26); lidská RNasa 1 obsahuje na karboxylovém terminálu o 3 aminokyseliny více než hovězí RNasa1 (4). Hovězí RNasa1 byla prvním enzymem, u kterého byla určena trojrozměrná struktura. Její celkový tvar připomíná ledvinku s aktivním místem v rozštěpu obsahujícím His12, His119 a Lys41 (25). Další nekatalytická vazebná místa pomáhají enzymu vytvářet komplex s polymerním substrátem. RNasa1 katalyzuje hydrolýzu 3′,5′-fosfodiesterových vazeb v jednovláknové RNA, pokud je bází na 3′ straně pyrimidin (7, 11, 23). Tento proces se obvykle představuje jako dvoufázový, přičemž první krok zahrnuje tvorbu cyklického fosfodiesteru a druhý jeho hydrolýzu (23). RNáza 1 DNA nehydrolyzuje, protože postrádá 2′-OH skupinu. To umožňuje její použití k odstranění kontaminace RNA z DNA. Používá se také v testech ochrany proti ribonukleáze. RNáza 1 tvoří dimery výměnou domén aminoterminálů za vzniku sulfhydrylových vazeb tak, aby každé aktivní místo zůstalo aktivní (18). Při zachování hydrolytické funkce získávají dimery další biologickou aktivitu, přičemž dimery, trimery a tetramery mají protinádorovou aktivitu

Superrodina ribonukleáz A

Lidský genom kóduje 122 samostatných ribonukleáz. Superrodina RNAse A se skládá z osmi „kanonických“ ribonukleáz s enzymatickou aktivitou a strukturní homologií k RNase A (15). Všechny jsou sekreční proteiny, které mají společnou terciární strukturu s disulfidovou vazbou a jsou schopny degradovat RNA. Všechny jsou kódovány v úzké oblasti chromozomu 14 u lidí i myší (27) a předpokládá se, že vznikly duplikací genů (3, 31). Ačkoli gen obsahuje několik exonů, na kódující oblasti se podílí jediný exon. Pochopení jejich fyziologické role není úplné, ale většina z nich je důležitá pro obranu hostitele a angiogenezi, stejně jako pro trávení (9). Prvním popsaným členem je RNáza 1, která kromě toho, že je pankreatickým enzymem, je produkována v různých buňkách včetně buněk cévního endotelu, kde po sekreci rozkládá cévní polymerní RNA a má anti-HIV-1 aktivitu (15). RNáza 2 a 3 jsou eosinofilní sekreční proteiny označované jako eosinofilní neurotoxin (EDN), resp. eosinofilní kationický protein (ECP) (15). RNáza 4 je přítomna v mnoha tkáních, ale její fyziologická role je nejasná. RNáza 5, známá také jako angiogenin, indukuje růst krevních cév (10). RNáza 7 je nejhojněji zastoupenou RNázou v kůži, zatímco RNáza 8 je exprimována v placentě (15). Další geny v klastru jsou příbuzné ribonukleázám (RNázy 9 až 13), ale jejich proteiny mají mutace zabraňující RNázové aktivitě. Některé z vylučovaných RNáz nebo jejich oligomery mohou vstupovat do buněk a působit cytotoxicky zejména na nádorové buňky.

Inhibitor ribonukleázy

Inhibitor ribonukleázy savců (RI) je cytosolický protein o velikosti 50 KDa, který se s vysokou afinitou a stechiometrií 1:1 váže na pankreatickou ribonukleázu, čímž ji inaktivuje (8, 17). Je zvláště hojně zastoupen v placentě a játrech a byl použit k purifikaci RNázy. Inhibuje všechny členy rodiny RNáz A. Její trojrozměrná struktura má tvar podkovy, která obsahuje repetice bohaté na leucin. Ačkoli biologická úloha není jasná, měla by vázat a inaktivovat všechny členy rodiny RNáz A, kteří uniknou sekreční cestě a dostanou se do cytoplazmy.

2. Úloha ribonukleázy v pankreatu

Většina buněk obsahuje milimolární koncentrace ribonukleotidů, ale pouze mikromolární koncentrace deoxyribonukleotidů (5). Strava tedy obsahuje směs ribonukleoproteinu, RNA a ribonukleotidů. Nukleoproteiny jsou rozkládány pankreatickou proteázou. Podle učebnicového názoru jsou nukleové kyseliny ze stravy rozkládány pankreatickou RNázou a DNázou ve střevě. Nedávná studie však ukázala, že pepsin v žaludku také hydrolyzuje nukleové kyseliny, takže toto trávení začíná tam (19). Mezi potraviny bohaté na ribonukleoproteiny patří orgánové maso, mořské plody a luštěniny (5).

Pankreatická RNáza (RNáza 1) je přítomna ve všech slinivkách obratlovců, ale její množství se značně liší (2). Mezi savce s velkým množstvím patří kopytníci, hlodavci a býložraví vačnatci. U krav tvoří RNáza 20 % trávicího enzymu; předpokládá se, že tento požadavek je způsoben velkou náloží RNA, kterou produkují bakterie z bachorové fermentace. U ostatních druhů včetně člověka, psa, kočky a nižších obratlovců je RNáza přítomna v mnohem menším množství a může tvořit pouze 0,5 až 1 % pankreatických enzymů. Ačkoli existuje pouze několik studií, zdá se, že pankreatická RNáza u všech druhů štěpí ve střevním lumen nukleovou kyselinu na nukleotidy, které jsou dále štěpeny střevní alkalickou fosfatázou a 5’nukleotidázou na nukleosidy a volné dusíkaté báze. Trávení nukleových kyselin má tedy luminální a kartáčovou fázi. Tyto produkty se vstřebávají enterocyty, ale většina se vylučuje močí; některé se používají k resyntéze především nalačno (13, 21, 29). Normálně se vstřebává 80 až 90 % nukleotidů, které se mohou stát esenciálními při některých onemocněních nebo v období omezeného příjmu či rychlého růstu (5).

Ribonukleáza je syntetizována v acinárních buňkách hrubými ER, skládána a balena do zymogenních granulí počínaje 20. dnem březosti u potkana (33). Ke skládání dochází v buňkách mnohem rychleji ve srovnání s izolovaným proteinem a kromě malého množství dimeru je každý protein, který nekončí jako složený monomer, degradován (12). Je vylučován do prostředí souběžně s ostatními trávicími enzymy pankreatickými laloky a aciny stimulovanými CCK nebo cholinergními analogy (14, 24, 28). Syntéza RNázy 1 je při experimentálním diabetu snížena o 50 %, ale mnohem méně než pokles u amylázy.

3. Nástroje pro studium ribonukleázy1

a. Protilátky

Biocompare (www.biocompare.com) uvádí 394 protilátek proti ribonukleáze od 32 dodavatelů. Některé jsou druhově specifické, jiné jsou specifické pro RNázu1 nebo jiné členy rodiny. Žádnou z těchto protilátek jsme netestovali

b. Ribonukleázová aktivita

Původní ribonukleázové testy využívaly hydrolýzu kvasinkové RNA; my jsme použili test popsaný Anfinsenem (1) k měření sekrece pankreatické ribonukleázy izolovanými akiny pankreatu potkana (24). Tyto testy však nejsou specifické pro RNázu1 a pro studium sekrece pankreatických acinů fungovaly, protože RNáza1 je hlavní formou přítomnou v pankreatických acinech. Byl také popsán test využívající hydrolýzu 2′-3′-fosfátu cytidinu (6). Nedávno byl vyvinut kvantitativní fluorescenční test založený na vazbě ethidium bromidu na kvasinkovou RNA (32).

4. Literatura

  1. Anfinsen CB, Redfield RR, Choate WL, Page J a Carroll WR. Studies on the gross structure, cross-linkages, and terminal sequences in ribonuclease [Studie hrubé struktury, křížových vazeb a terminálních sekvencí v ribonukleáze]. J Biol Chem 207: 201-210, 1954. PMID: 13152095
  2. Barnard EA. Biologická funkce pankreatické ribonukleázy. Nature 221: 340-344, 1969. PMID: 4974403
  3. Beintema JJ, and Kleineidam RG. Superrodina ribonukleáz A: obecná diskuse. Cell Mol Life Sci 54: 825-832, 1998. PMID: 9760991
  4. Beintema JJ, Wietzes P, Weickmann JL a Glitz DG. Aminokyselinová sekvence lidské pankreatické ribonukleázy. Anal Biochem 136: 48-64, 1984. PMID: 6201087
  5. Carver JD a Walker, WA. The role of nucleotides in human nutrition [Úloha nukleotidů ve výživě člověka]. J Nutr Biochem 6: 58 – 72, 1995.
  6. Crook EM, Mathias AP, and Rabin BR. Spectrophotometric assay of bovine pancreatic ribonuclease by the use of cytidine 2′:3′-phosphate. Biochem J 74: 234-238, 1960. PMID: 13812977
  7. Cuchillo CM, Nogues MV a Raines RT. Bovinní pankreatická ribonukleáza: padesát let prvního mechanismu enzymatické reakce. Biochemie 50: 7835-7841, 2011. PMID: 21838247
  8. Dickson KA, Haigis MC a Raines RT. Inhibitor ribonukleázy: struktura a funkce. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 80: 349-374, 2005. PMID: 16164979
  9. Dyer KD a Rosenberg HF. Superrodina RNáz a: generace diverzity a vrozená obrana hostitele. Mol Divers 10: 585-597, 2006. PMID: 16969722
  10. Fett JW, Strydom DJ, Lobb RR, Alderman EM, Bethune JL, Riordan JF a Vallee BL. Izolace a charakterizace angiogeninu, angiogenního proteinu z buněk lidského karcinomu. Biochemie 24: 5480-5486, 1985. PMID: 4074709
  11. Findlay D, Herries DG, Mathias AP, Rabin BR a Ross CA. Aktivní místo a mechanismus účinku hovězí pankreatické ribonukleázy. Nature 190: 781-784, 1961. PMID: 13699542
  12. Geiger R, Gautschi M, Thor F, Hayer A, and Helenius A. Folding, quality control, and secretion of pancreatic ribonuclease in live cells. J Biol Chem 286: 5813-5822, 2011. PMID: 21156800
  13. Ho CY, Miller KV, Savaiano DA, Crane RT, Ericson KA a Clifford AJ. Absorpce a metabolismus perorálně podávaných purinů u krmených a hladových potkanů. J Nutr 109: 1377-1382, 1979. PMID: 458492
  14. Iwanij V a Jamieson JD. Biochemická analýza sekrečních proteinů syntetizovaných normálním pankreatem potkanů a nádorovými buňkami pankreatických acinů. J Cell Biol 95: 734-741, 1982. PMID: 6185502
  15. Koczera P, Martin L, Marx G a Schuerholz T. The Ribonuclease A Superfamily in Humans: Kanonické RNázy jako opora vrozené imunity. Int J Mol Sci 17: 2016. PMID: 27527162
  16. Kunitz M. Crystalline Ribonuclease. J Gen Physiol 24: 15-32, 1940. PMID: 19873197
  17. Lee FS a Vallee BL. Struktura a působení inhibitoru savčí ribonukleázy (angiogeninu). Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 44: 1-30, 1993. PMID: 8434120
  18. Libonati M. Biological actions of the oligomers of ribonuclease A. Cell Mol Life Sci 61: 2431-2436, 2004. PMID: 15526151
  19. Liu Y, Zhang Y, Dong P, An R, Xue C, Ge Y, Wei L a Liang X. Digestion of Nucleic Acids Starts in the Stomach. Sci Rep 5: 11936, 2015. PMID: 26168909
  20. Marshall GR, Feng JA a Kuster DJ. Back to the future: ribonuclease A. Biopolymers 90: 259-277, 2008. PMID: 17868092
  21. McAllan AB. The degradation of nucleic acids in, and the removal of breakdown products from the thin intestines of steers. Br J Nutr 44: 99-112, 1980. PMID: 6158999
  22. Moore S a Stein WH. Chemické struktury pankreatické ribonukleázy a deoxyribonukleázy. Science 180: 458-464, 1973. PMID: 4573392
  23. Nogues MV, Vilanova M a Cuchillo CM. Bovinní pankreatická ribonukleáza A jako model enzymu s více vazebnými místy pro substrát. Biochim Biophys Acta 1253: 16-24, 1995. PMID: 7492594
  24. Otsuki M, and Williams JA. Vliv diabetes mellitus na regulaci sekrece enzymů izolovanými aciny pankreatu potkana. J Clin Invest 70: 148-156, 1982. PMID: 6177717
  25. Raines RT. Ribonuclease A. Chem Rev 98: 1045-1066, 1998.
  26. Reinhold VN, Dunne FT, Wriston JC, Schwarz M, Sarda L, and Hirs CH. Izolace prasečí ribonukleázy, glykoproteinu, z pankreatické šťávy. J Biol Chem 243: 6482-6494, 1968. PMID: 5715511
  27. Samuelson LC, Wiebauer K, Howard G, Schmid RM, Koeplin D a Meisler MH. Isolation of the murine ribonuclease gene Rib-1: structure and tissue specific expression in pancreas and parotid gland. Nucleic Acids Res 19: 6935-6941, 1991. PMID: 1840677
  28. Scheele GA a Palade GE. Studie slinivky břišní morčete. Paralelní vypouštění aktivit exokrinních enzymů. J Biol Chem 250: 2660-2670, 1975. PMID: 1123325
  29. Schwenk M, Hegazy E, and Lopez del Pino V. Uridine uptake by isolated intestinal epithelial cells of guinea pig. Biochim Biophys Acta 805: 370-374, 1984. PMID: 6210111
  30. Smyth DG, Stein WH, and Moore S. The sequence of amino acid residues in bovine pancreatic ribonuclease: revisions and confirmations. J Biol Chem 238: 227-234, 1963. PMID: 13989651
  31. Sorrentino S. The eight human „canonical“ ribonucleases: molecular diversity, catalytic properties, and special biological actions of the enzyme proteins. FEBS Lett 584: 2194-2200, 2010. PMID: 20388512
  32. Tripathy DR, Dinda AK a Dasgupta S. A simple assay for the ribonuclease activity of ribonucleases in the presence of ethidium bromide. Anal Biochem 437: 126-129, 2013. PMID: 23499964
  33. Van Nest GA, MacDonald RJ, Raman RK a Rutter WJ. Proteiny syntetizované a vylučované během vývoje pankreatu potkana. J Cell Biol 86: 784-794, 1980. PMID: 7410479

Leave a Reply

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.