Nanobody

4.3 BBB-crossing bsAbs engineered with single-domain antibodies

sdAbs jsou malé (15 kDa), monomerní antigen-vážící fragmenty protilátek, které poskytují různé výhody oproti jiným fragmentům protilátek jako „stavební bloky“ pro bsAbs. Vyskytují se v přírodě jako antigen-vázající část těžkých řetězců protilátek u velbloudovitých druhů (tzv. VHH) a chrupavčitých ryb (tzv. VNAR) nebo mohou být generovány z konvenčních IgG získáním nebo inženýrstvím monomerních, stabilních VH nebo VL domén (Hamers-Casterman et al., 1993; Hussack et al., 2012; Kim et al., 2014; Nuttall, 2012; Ward, Güssow, Griffiths, Jones, & Winter, 1989). sdAbs jsou vysoce stabilní a kompaktní a mohou přistupovat k zapuštěným epitopům v proteinech, jako jsou receptorové dutiny nebo aktivní místa enzymů, které jsou často „skryté“ před konvenčními IgG, a mohou dosahovat vazebných afinit k cíli srovnatelných s afinitami konvenčních protilátek (Lauwereys et al., 1998; Staus et al., 2014). Tyto monomerní vazebné jednotky antigenu se nepárují s lehkými řetězci, což z nich činí vynikající stavební bloky pro heterodimerizované bsAbs, protože se vyhýbají obtížím spojeným s nesprávným párováním lehkých řetězců (Hamers-Casterman et al., 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). Heterodimerní bsAbs lze vytvořit tak, že jedno nebo obě „ramena“ jsou sdAb, které mají podobnou strukturu jako protilátky s těžkým řetězcem u velbloudů (obr. 3E). sdAbs lze také použít v různých mono-, bi- nebo tetravalentních fúzích s konvenčními terapeutickými protilátkami nebo Fab (obr. 3E). 3E), což obecně vede k menším a méně komplexním molekulám ve srovnání s molekulami generovanými pomocí scFvs nebo Fabs jako stavebních bloků, které mají tendenci se biofyzikálně dobře chovat a snadno vyrábět (Holliger & Hudson, 2005). Humanizace VHHs stejně jako inženýrství sdAbs je dobře popsáno, což umožňuje snadno generovat human(izované) sdAbs s optimální cílovou afinitou a výjimečnými biofyzikálními vlastnostmi (Vincke et al.,

Pro vyhodnocení potenciálního použití velbloudích VHH FC5 jako nosiče BBB v rámci bispecifických protilátek zaměřených na CNS byly navrženy monovalentní a bivalentní fúze (N- a C-konec) FC5 s lidským Fc a vyhodnoceny in vitro a in vivo (Farrington et al., 2014). Zjevná vazebná afinita (Kdapp) k BEC potkana bivalentní fúze FC5Fc byla 75 nM, zatímco vazba monovalentní FC5Fc byla v mikromolárním rozmezí. Analýzy zdánlivé rychlosti transmigrace (Papp) přes model BBB in vitro, zdánlivé expozice CNS odvozené z farmakokinetiky séra/CSF systémově podávaných protilátkových konstruktů a farmakologických odpovědí vyvolaných chemicky konjugovanými neuroaktivními peptidy nepropustnými pro BBB v Hargreavesově modelu bolesti poskytly důkazy o zvýšeném transportu těchto velkých (75 kDa) protilátkových molekul přes BBB zprostředkovaném FC5: (1) hodnoty Papp in vitro byly ~ 200 cm/min pro mono- i bivalentní N-terminální fúzní molekuly Fc (FC5Fc) ve srovnání s 4-8 cm/min pro kontrolní VHH A20.1Fc nebo EG2Fc; (2) zjevná expozice fúze FC5Fc v CNS byla 30krát vyšší ve srovnání s fúziemi kontrolní domény protilátky a Fc; (3) systémová farmakologická účinnost konjugátů FC5Fc s neuropeptidy dalarginem nebo galaninem v Hargreavesově modelu zánětlivé bolesti byla až 60krát vyšší ve srovnání s monomerními konjugáty FC5-neuropeptid. Tento výsledek byl přičítán dlouhému cirkulačnímu poločasu (~ 96 h) konjugátů FC5Fc- ve srovnání s konjugáty FC5-neuropeptidů; (4) různé kontrolní konjugáty neuropeptidů VHH-Fc nevykazovaly žádnou systémovou účinnost; (5) fúze FC5 s C-koncem Fc vedla k oslabení schopnosti překonávat BBB. Na rozdíl od protilátek zaměřených na TfR s nosičem BBB vykazovaly mono- i bivalentní fúzní proteiny FC5Fc podobnou rychlost transcytózy in vitro, podobné farmakokinetické profily plazma/CSF a podobnou systémovou účinnost ve farmakodynamickém modelu in vivo, a to i přes rozdíly ve zjevné vazebné afinitě a valenci (Farrington et al., 2014). Tyto studie prokázaly, že BBB překračující jednodoménová protilátka FC5 může být použita jako platformní nosič BBB jak v podobě heterodimerizovaných „poloprotilátek“, tak jako snadněji škálovatelná bi- nebo tetravalentní fúze s konvenčními IgG (Farrington et al.,

Další potenciální výhodou VHH jako nosičů BBB je jejich přirozená odolnost vůči extrémním biofyzikálním výzvám, jako je teplota a pH, a také vůči degradaci proteázami (Kim et al., 2014), s nimiž se často setkáváme v různých endocytických kompartmentech během transcytózy. Fúze FC5 i FC5Fc jsou internalizovány do BEC prostřednictvím vezikul potažených klathrinem a jsou tříděny do časných endozomů. Zajímavé je, že bylo také zjištěno, že FC5 stimuluje vylučování extracelulárních mikrovezikul (exozomů) z BEC (Haqqani, Caram-Salas a kol., 2013; Haqqani, Delaney a kol., 2013), ve kterých byly pomocí Western blotu a cílené hmotnostní spektrometrie detekovány jak FC5, tak zvýšené hladiny jeho předpokládaného receptoru Cdc50A. Tato studie naznačila, že vyvržené exozomy mohou být konečným vezikulem dráhy RMT uvolněným z abluminálního povrchu, který nese komplex receptoru a protilátky (schematicky znázorněno na obr. 4). Dráha RMT a tvorba exozomů mají některé pozoruhodné podobnosti. Jak bylo nastíněno v prvním objevu exozomů, protilátka anti-TfR byla sledována elektronovou mikroskopií v retikulocytech (Théry, 2011) z povrchu buněk, do jamek potažených klathrinem, uvnitř časných endozomů, na povrchu vnitřních vezikul multivesikulárních endozomů a nakonec na uvolněných exozomech po splynutí multivesikulárních endozomů s plazmatickou membránou (obr. 4). Zdá se, že RMT se odvíjí podobným způsobem a bylo prokázáno, že extracelulární mikrovezikuly BEC obsahují několik receptorů, o nichž je známo, že přenášejí makromolekuly přes BBB prostřednictvím RMT, včetně TfR, LRP, LDLR a IR (Haqqani, Delaney a kol., 2013).

Z popsaných studií by mělo být zřejmé, že rameno nosiče BBB pro bsAb cílené na CNS vyžaduje pečlivou optimalizaci pro každý receptor RMT. Důležité úvahy při navrhování bsAb cílených na CNS jsou diskutovány níže s ohledem na „poučení“ z vývoje bsAb TfR-BACE1 a z naší vlastní práce s FC5 jako protilátkou s nosičem v BBB.

.

Leave a Reply

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.